Name: cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells
Uploaded: 2014-10-18T14:00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells at JoVE.com

Эта работа в первую очередь поддерживать на 5-UO1-ES016045 при частичной поддержке 1-R21-ES019498 и R44-ES021116. DMW была поддержана NIEHS подготовки Гранта в экологической токсикологии T32-ES007020. Оборудование было предоставлено Центром гигиены окружающей среды наук P30-ES002109.

1 Подготовка Chip <ol style="margin-left: 40px;"><li> Удалить чип гель от пакета и место в одной хорошо прямоугольная пластина, гель пленки стороне в вниз. </li><li> Промыть гель в 25 мл 1X PBS в течение 15 мин, повторить два раза. </li><li> Установите гель на стеклянную пластину и этикетки ориентации геля соответственно. </li><li> Аккуратно нажмите перевернутую бездонный 96-луночного планшета на гель; убедитесь, что все скважины бездонную пластины также находятся в зоне геля. </li><li> С помощью 1,5 &#39;&#39; зажимы с каждой стороны пластины, чтобы обеспечить фиксацию со стеклом. </li><li> Аспирируйте от избыточного PBS буфера в каждую лунку. </li></ol> 2. Загрузка Клетки <ol style="margin-left: 40px;"><li> Подготовьте клеточные суспензии: <ol><li> Для линий клеточной суспензии, разбавленной клеточной суспензии в среде, чтобы получить конечную концентрацию 10 5 -10 6 клеток / мл. </li><li> Для прикрепленных клеточных линий, в соответствии с обычными снятие / протоколы трипсинизации и гШилуте отдельные клетки в СМИ до конечной концентрации 10 5 -10 6 клеток / мл. Если клетки агрегируют, проходят клеточной суспензии в фильтре клеток для получения суспензии отдельных клеток. </li></ol></li><li> Добавить 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета. </li><li> Крышка с гелевой пленки для предотвращения испарения СМИ. </li><li> Разрешить клетки загрузить по крайней мере 30 мин в 37 ° С инкубатор. </li><li> Удалить чип из инкубатора и аспирата СМИ из каждой лунки. </li><li> Удалить зажимы и бездонный 96-луночного планшета; провести чип с стеклянной пластины под углом и осторожно промыть 1х PBS, чтобы удалить избыток клеток на агарозе. </li><li> Проверьте клеток загрузку с использованием светлого поля микроскопа с объективом 4X. Если наблюдается недостаточная загрузка, повторите процедуру с шага 2.1. </li><li> Поместите загруженный чип на ровной поверхности (лабораторном столе). Наложение чип с 1% низкой температурой плавления (LMP) агарозы, который предварительно нагревают при 37 ° С. Используйте приблизительно 2̵1, 3 мл агарозы LMP необходима для каждого чипа. </li><li> Разрешить наложения, чтобы закрепить первую при КТ в течение 3 мин, а затем перейти к 4 ° С холодильником в течение 5 мин для полной желатинизации. </li></ol> 3 Способ применения и Ремонт ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения исходного уровня повреждений ДНК, перейдите к шагу 4. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Тщательно выровнять скважин чипа (созданный из предыдущего зажима) с лунки новой бездонной 96-луночного планшета. Re-пресс кладязь 96-луночного планшета на верхней и надежного крепления с зажимы. </li><li> Добавить 100 мкл химического вещества желаемой дозы в каждую лунку 96-луночного планшета; выполнить дозирования / лечение на льду или в 4 ° C холодильнике в течение требуемого периода времени. </li><li> После дозирования, аспирация химических веществ из каждой лунки и смыть остатки вещества с помощью 1X PBS. Если прямой ущерб изучается здесь, перейдите к шагу 4. </li><li> Для изучения ремонт кинетики, позволяют клетки в чипе для ремонта вноситель при 37 ° С. Lyse (перейдите к шагу 4) в определенные моменты времени. Примечание: Ремонт может быть выполнена на чипе с бездонной 96-луночного планшета прилагаемой или чип может быть разрезана на отдельные куски после удаления бездонной 96-луночного планшета. </li></ol> 4 Lysis <ol style="margin-left: 40px;"><li> Для выполнения щелочной комет: <ol><li> Сделать работает щелочной буфере для лизиса путем добавления 1% Тритон Х-100 до щелочного лизиса маточного раствора (2,5 М NaCl, 100 мМ Na 2 EDTA, 10 мМ Трис, рН 10). Приготовьте примерно 25 мл лизирующего буфера работает для каждого чипа. </li><li> Предварительно охладить работает щелочной буфере для лизиса при 4 ° С. </li><li> Погрузите чип в прохладном рабочей щелочного буфера для лизиса и позволяют лизис выполнять O / N в 4 ° C холодильнике. </li></ol></li><li> Для выполнения комет в нейтральных: <ol><li> Сделать работает нейтральный буфере для лизиса путем добавления 1% Тритон Х-100 и 10% ДМСО в нейтральное лизиса маточного раствора (2,5 М NaCl, 100 мМ Na 2 EDTA, 10мМ Трис, 1% N -Lauroylsarcosine, рН 9,5). Приготовьте приблизительно 25 мл лизирующего буфера, работающих для каждого чипа. </li><li> Предварительно теплые работы нейтральный буфер для лизиса на 43 ° C. </li><li> Погрузите чип в теплой рабочей нейтрального буфера для лизиса и позволяют лизис выполнять O / N в 43 ° С инкубатор. </li></ol></li></ol> 5 электрофореза <ol style="margin-left: 40px;"><li> Для выполнения щелочной комет: <ol><li> Удалить буфер для лизиса и быстро промыть чип с 1x PBS. </li><li> Secure микросхема в камеру электрофореза с гель фильм стороной вниз, используя двухсторонний скотч. </li><li> Доведите камеру с 4 ° С холодной комнате. </li><li> Заполните камеру с холодной щелочной буфер для электрофореза (0,3 М NaOH, 1 мМ Na 2 EDTA) до уровня, который покрывает только гель. </li><li> Разрешить для щелочной раскручивания в течение 40 мин. </li><li> Запуск электрофореза на 1 В / см и 300 мА в течение 30 мин в холодном помещении. Регулировка громкости буфер для электрофореза в чаMBER для достижения желаемого рабочего тока. </li></ol></li><li> Для выполнения комет в нейтральных: <ol><li> Удалить лизирующего буфера и промыть чип с нейтральным буфером электрофореза (2 мМ Na 2 EDTA, 90 мМ Трис, 90 мМ борной кислоты, рН 8,5) в течение 2 х 15 мин при 4 ° С. </li><li> Secure микросхема в камеру электрофореза с гель фильм стороной вниз, используя двухсторонний скотч. </li><li> Доведите камеру с 4 ° С холодной комнате. </li><li> Заполнить камеру с холодной нейтральной буфера электрофореза (2 мМ Na 2 EDTA, 90 мМ Трис, 90 мМ борной кислоты, рН 8,5) до уровня, который покрывает только гель. </li><li> Разрешить гель сидеть в холодной комнате в течение 60 мин. </li><li> Запуск электрофореза на 0,6 В / см и 6 мА в течение 60 мин в холодном помещении. Регулировка громкости буфер для электрофореза в камере для достижения желаемого рабочий ток. </li></ol></li></ol> 6 флуоресцентных изображений <ol style="margin-left: 40px;"><li> Удалить чип от электрофореза камеры от перевалад комната. </li><li> Нейтрализовать гели в нейтрализации буфера (0,4 М Трис, рН 7,5) в течение 2 х 15 мин в 4 ° C холодильником. </li><li> Пятно чип с флуоресцентным красителем ДНК выбора (т.е., SYBR Gold, этидийбромид) под фабрикой рекомендованных процедур. Изображение с помощью флуоресцентной микроскопии. </li></ol> Анализ 7. данных Анализ кометы изображений по стандартной кометы программного обеспечения для анализа, такие как Комет 5,5.

<ol>
	<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comet+Assay+for+DNA+Damage+and+Repair+Principles,+Applications,+and+Limitations.">The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).</li><li>Olive, P. L., Ban&#225;th, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature. 1 (1), 23-29 (2006).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation+induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+trapping+and+DNA+damage+analysis+using+microwell+arrays.">Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).</li><li>Weingeist, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+enables+high-throughput+evaluation+of+DNA+double-strand+breaks+and+DNA+repair+inhibitors.">Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors.</a> Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).</li><li>Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+comet+assay:+use+and+status+in+genotoxicity+testing.">The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing.</a> Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).</li><li>Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+toxicity+assessment:+employing+the+best+science+for+human+safety+evaluation+part+III:+the+comet+assay+as+an+alternative+to+in+vitro+clastogenicity+tests+for+early+drug+candidate+selection.">Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection.</a> Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>M&#248;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+of+environmental+agents+assessed+by+the+alkaline+comet+assay.">Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay.</a> Basic &amp; clinical pharmacology &amp; toxicology. 96, 1-42 (2005).</li><li>Dusinska, M., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+in+human+biomonitoring:+gene-environment+interactions.">The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions.</a> Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+the+comet+assay+in+the+clinical+management+of+cancer.">Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer.</a> Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidatively+generated+damage+to+the+guanine+moiety+of+DNA:+mechanistic+aspects+and+formation+in+cells.">Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells.</a> Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).</li><li>Forchhammer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+measurement+of+DNA+damage+by+comet+assay+measured+by+the+ECVAG&#8224;+inter-laboratory+validation+trial.">Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG&#8224; inter-laboratory validation trial.</a> Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).</li><li>Olive, P. L., Wlodek, D., Ban&#225;th, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks+measured+in+individual+cells+subjected+to+gel+electrophoresis.">DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis.</a> Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).</li><li>Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography--tandem+mass+spectrometry+measurement+of+radiation-induced+base+damage+to+isolated+and+cellular+DNA.">High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA.</a> Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).</li><li>Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively-induced+clustered+DNA+lesions+using+a+novel+adaptation+of+single+cell+gel+electrophoresis+(comet+assay).">Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay).</a> Current protocols in cell biology. , (2010).</li><li>Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DNA+alkylation+damage+and+repair+in+mammalian+cells+by+the+comet+assay.">Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay.</a> Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).</li><li>Collins, A. R., Dusinsk&#225;, M., Horsk&#225;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alkylation+damage+in+human+lymphocyte+DNA+with+the+comet+assay.">Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay.</a> Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).</li><li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+fluorescent+imaging+of+live+cells+is+highly+genotoxic.">Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).</li><li>Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+repair+capacity+in+human+populations.">A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations.</a> Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).</li><li>Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation+and+DNA+repair+efficiency+in+a+healthy+population.">Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population.</a> Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).</li></ol>

The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

Вездесущие генотоксинов в окружающей среде, а также в пределах клеток человека оказывают неизбежное напряжение и повреждение клеточной ДНК. На самом деле, было подсчитано, что есть 1000 с повреждений ДНК, присутствующих в клетках человека в устойчивом состоянии 18. Понимание повреждаемость и ремонт кинетики у человека не только приносит понимание в области фундаментальных исследований, но и приносит пользу развитию наркотиков. Как ни странно, несмотря на способность повреждения ДНК содействия рак, повреждающих ДНК агентов используются на очень высоких уровнях, чтобы лечить рак, делая знания о повреждении ДНК и ремонт отношение к персонализированной медицины. CometChip является роман исследования устройство, которое использует практику микротехнологий революционизировать на повреждения ДНК анализа давно существовала. Основываясь на тех же принципах традиционной комет, чип обеспечивает значительно более высокую пропускную способность и лучшую воспроизводимость. Мы описываем здесь способы использования этого чипа. Для уточнения его полезность и надежность, мы покажем результаты сюдам несколько экспериментов, где чип была использована для оценки ущерба, вызванную несколькими отличается повреждающих ДНК агентов, и где она была использована для оценки репарации ДНК. Вместе, представленные здесь результаты предоставить полезную информацию для использования чип и продемонстрировать свою широкую применимость к исследованию на повреждения и репарации ДНК. Одним из наиболее важных шагов в этом протоколе есть для достижения эффективную погрузку клеток. Многие клеточные линии были протестированы на этой системе, в том числе как подвески и прилипшие клетки. Загрузка эффективность зависит от многих факторов, таких как тип клеток, размер клеток, концентрации и времени загрузки. Подвеска клеточные линии, такие как лимфобластоидных клеток являются самым простым в работе. Концентрация клеточной суспензии может составлять от 10 4 до 10 6 клеток на 96-луночный и загрузка обычно завершается в 15-30 мин. Более высокая плотность клеток облегчает загрузку и сокращает количество времени, необходимого для урегулирования клеток в лунках. Загрузка параметры для адгезивных клеток может отличаться от суспензии клеток. Клеточные линии, такие как рак яичника китайского хомячка (СНО), было установлено, что подобное эффективность загрузки в виде суспензии клеток (после обработки трипсином) и, таким образом, использовать аналогичные условия нагрузки. Другие типы клеток, такие как опухолевые клетки, которые легко образуют клеточных агрегатов в суспензии, требуют дополнительной обработки. Переходя клеточных суспензий с помощью одного фильтра клеток и добавление трипсина в суспензионной среды может подавлять образование кластеров клеток во время загрузки. И, наконец, с точки зрения времени загрузки, время, необходимое для захвата прикрепленных линий клеток в лунках может варьировать от 20 минут до 1 часа. В результате, рекомендуется пользователям выполнять пилотные эксперименты по определению оптимальных условий загрузки, прежде чем приступить к дальнейших исследований. Загрузка эффективность может быть визуализирована в светлом поле микроскопа или, точнее, показал окрашиванием инкапсулированных клеток с DAPI или другой ДНКпятна до их оценки под флуоресцентным микроскопом. Одно из главных преимуществ этого метода и чипа универсальность. Во-первых, исследователи не ограничиваются определенной концентрации рабочей клеток, потому что избыточные клетки смываются, и микрочипов обеспечивает равномерное кометы плотности. Во-вторых, лунки могут быть сделаны с различных размеров, чтобы вместить типов клеток различных размеров. В условиях, что несколько клеток, фиксируемых на одной микролунку, нескольких ячеек кометы являются самостоятельными откалиброван и доходности соответствует результаты по сравнению с одиночными комет клеток 6,7. Еще одно преимущество рисунка клетки в микрочипе, что все кометы, то в то же фокальной плоскости с фиксированными положениями, уменьшая шум в связи с нефокусированных комет и облегчения автоматизированной обработки изображений и анализа. Значительные улучшения в производительности и чувствительности, предоставляемые CometChip возможности применения анализа для масштабных исследований. Взятые вместе, чип обеспечиваетса ценным инструментом для оценки ущерба ДНК для исследователей, токсикологов, врачей и эпидемиологов. В то время как метод ДНК-комет известен своей отличной чувствительностью в обнаружении широкий спектр повреждений ДНК, этот анализ также страдает от низкой специфичности. Используя этот протокол значительно улучшает воспроизводимость и пропускную способность анализа, но не демонстрирует прогресс в специфичности. Тем не менее, мультиплексирование с другими анализа методик было сообщено, чтобы быть эффективными в достижении более высокой специфичностью. Одним из примеров является включение очищенных поражения конкретных ферментов. Эти ферменты могут конвертировать в противном случае недетектируемые базовых поражений в обнаруживаемых разрывов ДНК и лишенного основани звена сайтов 1,19-21. Широко используемым примером является ремонт эндонуклеазы гликозилаза формамидопиримидин-ДНК (Fpg), которая показывает изменения окислительного ДНК 19,22. Поскольку шаг ферментативного расщепления применяется после лизиса клеток, система может рассматриваться же образомса традиционный агарозы слайд без изменений в протоколе. Хотя Подробный протокол здесь не описывается, этот подход был адаптирован многими традиционными кометных пользователей анализа в прошлом, и протоколы могут быть легко найдены. В предыдущей публикации мы использовали этот метод для идентификации люминесцентные индуцированных повреждений 22. Основным преимуществом этого метода является пропускная он обеспечивает, которая открывает двери для исследований, которые ранее были практически невозможно. Способность обрабатывать 96 образцов на той же платформе, не только снижает затраты труда и времени, но и снижает экспериментальные шумы и значительно повышает воспроизводимость. Интер вариации выборки значительно ниже, чем традиционной слайд-к-слайд изменения, которые могут быть в 2 раза выше, чем различий, наблюдаемых с этим чипом 6,7. Пониженный уровень шума также приводит к улучшению чувствительности, что позволяет определять более тонких различий между образцами. Поскольку устройство использует STAndard 96-а, она совместима с общей исследовательского оборудования и HTS технологий. Рассмотрим исследование, которое требует оценки 100 образцов, при условии, что средняя исследователь может обрабатывать ~ 30 стеклянные слайды более в течение нескольких дней. Учитывая, что каждый образец должен быть выполнен в трех экземплярах, потребовалось бы приблизительно одного месяца, чтобы завершить такое исследование, которое также неизбежно страдают от образца к образцу изменение. В отличие от этого, обработка 100 условия, каждая в трех экземплярах, с этого чипа требуется всего лишь несколько пластин и может быть выполнена в течение трех дней. Это значительное улучшение пропускной открывает двери для исследований, которые ранее были недостижимы. Протокол, представленные здесь описывает как основные процедуры для выполнения стандартного комет и измененные шаги, необходимые для использования CometChip платформу. С возможностью измерения оба уровня, присущие повреждения ДНК и последующее ответ ремонта, анализ является весьма актуальным дляразнообразие биологических и клинических применений. Информация о воздействии определенных химических воздействий на геном облегчает профилактики и лечения заболеваний. Кроме того, есть также значительный интерес в определении различий в чувствительности повреждения ДНК и ремонтных мощностей среди лиц 23,24. Эта техника обеспечивает пропускную необходимое для таких масштабных исследований. Знания о том, индивидуальных вариаций имеет решающее значение для выявления восприимчивых людей и для проектирования индивидуальных методов лечения или профилактику стратегии. Взятые вместе, технология, представленная здесь обеспечивает высокую пропускную способность, объективную и количественную платформу анализа повреждений ДНК, которая имеет потенциал, чтобы стать стандартной методологии в ближайшем будущем.

Электрофорез Сингл гелевые (SCGE) анализ (ака комет) является широко используемым методом для количественного определения широкого спектра повреждений ДНК, в том числе базовых поражений, лишенного основани звена сайтов, одиноких разрывов ДНК, двойные разрывов ДНК, сшивки и щелочей чувствительны сайты. Главный принцип анализа является то, что поврежденная ДНК мигрирует более охотно, чем неповрежденной ДНК в результате фрагментации и потери сверхвитков структуры. Степень миграции пропорциональна количеству повреждений ДНК, и может быть визуализирована с помощью флуоресцентной микроскопии. Изображение-захвата и профиль интенсивности анализ индивидуального кометы в форме ДНК затем доставить измерения параметров, таких как длина хвоста, момент хвост, и% ДНК в хвосте, чтобы выявить уровень повреждений ДНК в клетке 1-4. В настоящее время существует два широко используемых версий комет: а) щелочная комет и б) комет в нейтральных. Щелочная комет является наиболее широкоб версия, которая использует высокую рН буфер, чтобы расслабиться ДНК перед электрофореза и таким образом обнаруживает все типы разрывов ДНК и щелочно-чувствительных участков. Комет в нейтральных, с другой стороны, менее практикуется, поскольку он использует нейтральный буфер для поддержания двойных спиралей и обнаруживать только двойные разрывы цепи 2,5. Для химических и физических агентов, которые вызывают DSBs, SSBs создаются в концерте, и образуются при значительно более высоких уровнях (например, γIR-индуцированные SSBs являются на порядок чаще, чем DSBs). Для большинства повреждающих ДНК экспозиций, ДР гораздо реже, чем другие классы повреждений ДНК, и, следовательно, труднее обнаружить. Мы показали в предыдущих публикациях окно обнаружения обеих версий. 6,7 Хотя комет регулярно используется для проведения фундаментальных исследований на повреждения ДНК и ремонта и генотоксичности испытаний 1,2,8-15, анализ был сообщили, что плохую воспроизводимость благодаря образца-to-образец, от человека к человеку и лабораторного к-лаборатории изменчивости. Кроме того, анализ является низкая пропускная способность, отчасти потому, что захвата изображений и анализа данных являются трудоемкими. Вместе, эти ограничения способствуют его относительно низкой принятия в крупномасштабных исследований. Благодаря интеграции инженерных технологий и принципов, CometChip приносит решение проблем пропускной способности и несоответствий, которые связаны с традиционной комет 6,7. Вкратце, для создания чипа, форма микроизготовленном помощью фотолитографии для создания Microposts с диаметром как малые, как, что из одной клетки. Затем пресс-форму используется, чтобы печать на расплавленного агарозы, в результате чего массив лунок после гель затвердевает. Фишки разрабатывается для обеспечения исследователей переменного размера скважин совместимы с различными типами клеток. Чтобы загрузить чип, клетки в СМИ дают осесть в лунки под действием силы тяжести; избыточные клетки смываются. Trapped клетки затем инкапсулируются насчисле тонкий слой с низкой температурой плавления агарозы, и бездонный 96-луночный планшет, затем прижать к поверхности геля, чтобы создать 96 macrowells, каждый из которых сотни лунок на его нижней поверхности. Этот протокол описывает общие процедуры для экспериментов с этим чипом, которые включают подготовку гель, сотовый загрузку, дозирование и ремонт, лизис клеток, электрофорез и флуоресцентных изображений. Мы демонстрируем два примера экспериментов доза-ответ с лимфобластных клеток, подвергшихся известно ДНК повреждающих агентов, используя щелочные и нейтральные версии анализа соответственно. Два эксперимента ремонт также показаны описать, как реакция ремонт после контакта может быть оценена с помощью системы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

Watch this Scientific Journal Video about CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells at JoVE.com

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Мы описываем здесь платформу, которая позволяет кометы обнаружения анализа повреждений ДНК с беспрецедентной пропускной способности. Узоры устройств клетки млекопитающих в микрочипов и позволяет параллельную обработку 96 образцов. Подход облегчает анализ повреждения ДНК базовый уровень, экспозиция индуцированных повреждений ДНК и репарации ДНК кинетики.

CometChip: Высокая пропускная 96-Ну Платформа для измерения повреждений ДНК в Microarrayed клетках человека

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Альгината микрокапсулы в качестве 3D-платформа для распространения и дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) для разных линий

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Полимерные Microarrays высоких Discovery Пропускная биоматериалов

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Микрофлюидных Платформа для измерения хемотаксис нейтрофилов из необработанного цельной крови

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Использование высокой пропускной<em&gt; In Vitro</em&gt; Микрожидкостных систему для разработки Устные биопленки Многовидовые

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Микрожидком Платформа с высокой пропускной способностью изоляции одноклеточные и культуры

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Высокая пропускная способность сотовых микрочипов платформы для корреляционного анализа клеточной дифференциации и тяговых усилий

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Использование высокопроизводительного автоматизированная система Microbioreactor для производства модель IgG1 в клетках Чо

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Высокая пропускная способность Дрожжи Штамм Фенотипирование с капли на основе РНК секвенирования

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...