Name: self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2013-11-07T19:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture at JoVE.com

Die Finanzierung aus dem BBSRC wird freundlich quittiert (Förderkennzeichen BB H011293 / 1).

Überblick Abschnitt 1 beschreibt die Herstellung von pH-Wert reagieren Nanosensoren und Charakterisierung von Nanosensor Reaktion auf pH-Wert mit Fluoreszenzspektroskopie und ihrer Größe mit SEM. Abschnitt 2 beschreibt die Herstellung von elektroPolymerGerüsten und Charakterisierung von ihrer Morphologie und Größe mit SEM. Abschnitt 2 beschreibt auch die Herstellung von Selbstberichts Gerüste, die elektro Gerüste mit der Aufnahme der pH-Wert reagieren Nanose...

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	<li>Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+liver+tissue+formation+in+rats+using+a+novel+collagen-polypropylene+scaffold.">De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold.</a> Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).</li><li>Sales, V. L., Engelmayr, G. 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Tissue Engineering strebt biologischen Ersatz zu schaffen, die sowohl in vivo wie in vitro Gewebemodellen und in Gewebeersatztherapie verwendet werden können, um zu reparieren, zu ersetzen, aufrecht zu erhalten oder zu verbessern die Funktion eines bestimmten Gewebe oder Organ. Synthetische Ersatzstoffe verwendet wurden, für viele Jahre zu Hilfe Reparatur von Gewebe zu ersetzen oder aber diese oft nicht aufgrund der schlechten Integration in das Wirtsgewebe und / oder Infektion, die letztlich zu Able...

Eine Schlüsselstrategie im Tissue Engineering ist die Verwendung von biokompatiblen Materialien, um Gerüste, deren Morphologie ähnelt das Gewebe, es geht zu ersetzen und ist auch in der Lage ist das Zellwachstum und Funktion 1,2 herzustellen. Das Gerüst mechanischen Halt, indem die Zellhaftung und Proliferation ermöglicht Zellmigration noch in den Zwischenräumen eines 3D-Zellkonstrukt. Das Gerüst muss auch für den Massentransport von Zelle Nährstoffe zu ermöglichen und Abtransport von Stoffwechsel 3 nicht hemmen. Elektro wurde als vielversprechendes Verfahren zur Herstellung von polymeren Gerüsten in der Lage ist das Zellwachstum 4-6 entstanden. Die hergestellten Vlieselektrogesponnenen Fasern sind für das Zellwachstum, wie sie sind oft porös und ermöglichen Zell-Zell-Wechselwirkung als auch die Zellmigration in den Zwischenräumen eines 3D-Zellkonstrukt 7. Es ist wichtig, die Lebensfähigkeit der Zellen während t überwachener Kulturperiode und diese Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten ist in der gesamten 3D-Konstrukt erhalten. Beispielsweise Kulturbedingungen, wie beispielsweise Sauerstoff und pH erfordern eine sorgfältige Kontrolle, wie Gradienten in Analytkonzentration innerhalb des 3D-Konstrukt vorhanden sind. Bioreaktoren oder Perfusions-Systeme eingesetzt werden, um in vivo-Bedingungen der interstitiellen Fluss und als Ergebnis Anstieg Nährstofftransfer und Stoffwechselabfallbeseitigung 8 imitieren. Die Frage, ob solche Systeme eine konstante Mikroumgebungsbedingungen, kann durch die Beurteilung der zellulären Mikroumgebung in Echtzeit behandelt werden. Schlüssel Mikro Metriken, die in Echtzeit überwacht werden könnten, umfassen: Temperatur, chemische Zusammensetzung der Zellmedien, die Konzentration von gelöstem Sauerstoff und Kohlendioxid, pH-Wert und Feuchtigkeit. Von diesen Messdaten kann die Temperatur am leichtesten überwacht werden unter Verwendung von in situ-Sonden. Methoden für die Überwachung der übrigen aufgeführten Kennzahlen häufig involve Entfernung eines aliquoten für die Probenahme und deshalb stören die Zellkultur und das Kontaminationsrisiko zu erhöhen. Kontinuierliche Echtzeit-Methoden werden gesucht. Aktuelle Überwachungsmethoden der Regel verlassen sich auf Instrumente, die körperlich untersuchen die zelluläre Konstrukt wie einem pH-Monitor oder Sauerstoffsonde. Allerdings können diese invasiven Methoden der zellulären Konstrukt schädigen und stören den laufenden Experiments. Nichtinvasive Überwachung des Analyt-Konzentrationen in der 3D-Konstrukt konnte die Echtzeitüberwachung von verschiedenen Umweltaspekte wie Nährstoffverarmung 9 zu ermöglichen. Dies würde Beurteilung der Nährstoffzufuhr in tiefere Regionen innerhalb der Struktur zu ermöglichen und zu bestimmen, ob Stoffwechselschlacken wurde effektiv 10,11 entfernt. Systeme, die mit der Frage der Invasivität ehen versuchen im allgemeinen die Verwendung eines Durchblutung Kammer, die Kulturmedium sowohl durch das Kulturgefäß und an externe Sensoren geht auf pH-Wert, Sauerstoff-und Glukose-Monitor 12. DieRe ist ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung Sensoren, die direkt in das Kulturgefäß, das keine Entfernung eines Aliquots zum Abtasten erfordern und als solche in-situ-Überwachung vorsehen würde integriert werden können. Um solche Mängel zu adressieren in situ und nichtinvasive Überwachung des Mikroumgebungsbedingungen haben wir Analyten reagiert Nanosensoren in die elektro Gerüste eingebaut, um Selbst-Berichterstattung Gerüste 13 zu produzieren. Leitschienen, die als Sensoren wirken durch Überwachen Fluoreszenzaktivität vorher hergestellt worden ist, wobei die Erfassungsvorrichtung entweder die tatsächlichen Polymergerüst die durch Elektrospinnen oder durch den Einsatz eines Analyten ansprechenden Farbstoff, der in das Polymer vor der Gerüstbildung 14,15 aufgenommen wird . Allerdings haben diese Messvorrichtungen das Potenzial, fehlerhafte optische Ausgänge durch mögliche Störungen von anderen Analyten verursacht zu geben. Die Verwendung eines ratiometrischen Erfassungseinrichtung such wie in dem beschriebenen Protokoll hergestellt hält das Potential, diese mögliche Nebenwirkungen zu beseitigen und eine Antwort für den Analyten spezifisch in Frage. Die hier vorgestellten elektro Gerüste wurden aus dem synthetischen Copolymers Poly (milch-co-Glykolsäure) (PLGA) erstellt wurde, durch ausgewählte, die Food and Drug Administration (FDA) die Genehmigung, die aufgrund ihrer biologischen Abbaubarkeit und Biokompatibilität und eine Spur Rekord, das Wachstum und die Funktion der verschiedenen Zelltypen 16-18. Die vorbereiteten ratiometrischen Analyt reagiert Nanosensoren reagieren auf pH-Wert. Die Nanosensoren sind mit zwei Fluoreszenzfarbstoffe in ein Sol-Gel biokompatiblen Matrix, einen Farbstoff, FAM ist in Reaktion auf pH-Wert und die andere wirkt TAMRA als interner Standard, da es nicht in Reaktion auf pH-Wert. Ferner die Fluoreszenz sowohl des FAM und TAMRA separat analysiert, da sie nicht wesentlich überlappen. Bestimmung des Verhältnisses der Fluoreszenz EMISsion beider Farbstoffe bei bestimmten Wellenlängen einen pH-Antwort unabhängig von anderen Umgebungsbedingungen. Die selbst Berichterstattung Gerüste könnten Wiederholungs Beurteilung der pH-Wert in situ und in Echtzeit ermöglichen, ohne dass der entwickelte 3D-Modell. Wir haben gezeigt, dass diese Gerüste sind in der Lage ist die Zellhaftung und-proliferation und weiterhin in Reaktion auf den Analyten in Frage. Die Kinetik der sauren Nebenprodukte in Konstrukte bleibt under und als solche mit den pH anspricht Gerüste könnte erheblich erleichtert diese Untersuchungen 19. Darüber hinaus stellt die Verwendung der Selbstberichts Gerüste für Tissue-Engineering-Anwendungen die Möglichkeit, vollständig zu verstehen, zu überwachen und optimieren das Wachstum von 3D-Modell in vitro Gewebekonstrukte, nicht-invasiv und in Echtzeit. Die pH-Nanosensoren reagieren auch auf die intrazelluläre Umgebung von Fibroblasten auf PLGA elektro Gerüsten kultiviert geliefert wordends. Das Verhältnis der Fluoreszenzemission von der Farbstoffe wurden verwendet, um pHi überwachen und im Vergleich zu einem Selbst-Berichterstattung Gerüst Einarbeiten pH Nanosensoren. Die Lieferung von Nano Zellen in einer 3D Umgebung kultiviert konnte Überwachung Analytkonzentration tief innerhalb des Konstrukts in einer zerstörungsfreien Art und Weise zu ermöglichen. Daher Nanosensoren kann eine tragfähige Imaging-Tool, um zerstörungsfrei beurteilen Zellverhalten im gesamten 3D-Konstrukte ermöglicht langfristige Analyse sein. Screening der Analytkonzentration von einzelnen Zellen in einer 3D-Konstrukt könnte sicherstellen, dass sie ausreichend mit Nährstoff-und Sauerstoffkonzentrationen. Überwachungsverfahrensparameter konnte bei der Entwicklung von standardisierten Techniken zur effektiven Massentransport von Sauerstoff und Nährstoffen zu unterstützen. Die Lieferung von Nanosensoren auf die intrazelluläre Umgebung und Einbau von Nanosensoren in polymere Gerüste könnten kombiniert werden, die Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen sowie Gerüst Leistung in 3D const ermöglichenructs während der Gewebewachstumsprozess. Dies kann zu mehr Wissen dieser Konstrukte führen und Fortschritte die Herstellung von biologisch relevanten Gewebeersatz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">32221</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Anhydrous dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">270547</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:137px;">35574</td>
			<td style="width:79px;">diluted to 30% (v/v) with pure water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">TEOS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">13190-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A3648</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1311</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1171</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate monobasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-0876</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaOH</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S8045</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T4174</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P0781</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D6046</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:137px;">Batch-213-101992</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G7513</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Optimem</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11058-021</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">LysoTracker Red</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">L-7528</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Draq5</td>
			<td style="width:71px;">Biostatus Ltd</td>
			<td style="width:137px;">DR50050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DCM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">320269</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">TFA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T6508</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="211">
			<td height="211" style="height:211px;width:195px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica TCS-SP</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">UV light</td>
			<td style="width:71px;">UVLS28 UVP, USA</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Stirrer plate</td>
			<td style="width:71px;">SB161-3 Jencons-PLS</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:71px;">Jenway model 3510</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:71px;">Buchi Rotary Evaporator R200</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Centrifuge (nanosensors)</td>
			<td style="width:71px;">Hermle Z300</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">Centrifuge (cell culture)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Whirlimixer Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Ultrasonicator</td>
			<td style="width:71px;">FB11021 Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Aluminum sheet</td>
			<td style="width:71px;">Nottingham University</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">35mm cell culture plate</td>
			<td style="width:71px;">Iwaki</td>
			<td style="width:137px;">3000035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">3T3 Fibroblast cells</td>
			<td style="width:71px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">PLGA</td>
			<td style="width:71px;">Lakeshore Biomaterials</td>
			<td>7525 DLG 7E</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pyridinium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P8535</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture

Kultivieren von Zellen in 3D auf entsprechenden Gerüsten wird gedacht, um besser imitieren die In-vivo-Mikroumgebung und erhöhen die Zell-Zell-Interaktionen. Das resultierende 3D-Zellkonstrukt kann oft mehr relevant für die Untersuchung der molekularen Ereignisse und Zell-Zell-Interaktionen als vergleichbare Experimente untersucht in 2D. Um wirksam zu 3D-Kulturen mit hoher Zelllebensfähigkeit in der gesamten Gerüst erstellen die Kulturbedingungen, wie Sauerstoff und pH-Wert müssen sorgfältig wie Gradienten in Analyt-Konzentration gesteuert werden kann in der gesamten 3D-Konstrukt existieren. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren und deren Einbau in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste sowie deren anschließende Herstellung für die Kultur von Säugetierzellen. Die pH anspricht Gerüste können als Werkzeuge zur pH der Mikroumgebung innerhalb eines 3D-Zellkonstrukt bestimmen werden. Darüber hinaus haben wir ausführlich die Lieferung der pH-Wert reagieren nanosensors auf die intrazelluläre Umgebung von Säugerzellen, deren Wachstum durch elektro PLGA Gerüste unterstützt. Die zytoplasmatische Lokalisierung der pH anspricht Nanosensoren können verwendet werden, um intrazellulären pH (pHi) im laufenden Experimenten überwachen.

Die Größenverteilung der hergestellten pH-Wert reagieren Nanosensoren wurde mit SEM, wo die Bevölkerung von Nanosensoren abgebildet wurden gemessen und mit Nanometer-Dimensionen im Bereich von 240 bis 470 nm (Abbildung 1A) gekennzeichnet haben. Das Erreichen einer engen und relativ kleinen Durchmesser ist konsistent mit der Verwendung der Stöber-Methode, um Nanopartikel herzustellen. Es wurde festgestellt, dass mit einem basischen pH-Umgebung während der Synthese von Nanopartikeln, dh Nano...

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren können in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste eingebracht werden. Die hergestellten Selbstberichts Gerüste können für die in situ Überwachung von Mikroumgebungsbedingungen, während die Kultivierung von Zellen auf dem Gerüst verwendet werden. Dies ist vorteilhaft, da die 3D-Zellkonstrukt kann in Echtzeit, ohne den Versuch zu stören überwacht werden.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Synthese von biokompatiblen Liquid Crystal Elastomerschäume als Zellgerüste für 3D Spatial Zellkulturen

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