Name: self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2013-11-07T19:15:00
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I finanziamenti del BBSRC è gentilmente riconosciuto (codice di autorizzazione BB H011293 / 1).

Panoramica Sezione 1 descrive la preparazione di pH nanosensori reattivo e la caratterizzazione della risposta nanosensori a pH utilizzando la spettrometria di fluorescenza e la loro dimensione al SEM. Sezione 2 descrive la preparazione di elettrofilate scaffold polimerici e caratterizzazione della loro morfologia e dimensioni utilizzando SEM. Sezione 2 descrive anche la preparazione di scaffolds self-reporting, che sono ponteggi elettrofilate con l&#39;inclusione d...

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	<li>Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+liver+tissue+formation+in+rats+using+a+novel+collagen-polypropylene+scaffold.">De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold.</a> Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).</li><li>Sales, V. L., Engelmayr, G. 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L&#39;ingegneria tissutale aspira a creare sostituti biologici che può essere utilizzato sia come in vivo come modelli in vitro e in tessuto in terapia sostitutiva tessuto di riparare, sostituire, mantenere o migliorare la funzione di un particolare tessuto o organo. Sostituti sintetici sono stati utilizzati per molti anni a sostituire o riparare ausilio di tessuti, ma questi spesso falliscono a causa della scarsa integrazione con il tessuto ospite e / o infezione, che alla fine porta al rifi...

Una strategia chiave nell&#39;ingegneria dei tessuti è l&#39;uso di materiali biocompatibili per fabbricare scaffold cui morfologia assomiglia al tessuto che sta per sostituire ed è anche in grado di sostenere la crescita e la funzione delle cellule 1,2. L&#39;impalcatura fornisce supporto meccanico consentendo attaccamento cellulare e la proliferazione tuttavia permette la migrazione cellulare durante gli interstizi di un costrutto cellulare 3D. Il ponteggio deve permettere il trasporto di massa di nutrienti cellulari e non inibire la rimozione dei rifiuti metabolici 3. Electrospinning è emerso come un metodo promettente per la realizzazione di supporti polimerici in grado di supportare la crescita cellulare 4-6. Le fibre elettrofilate non tessuti prodotti sono adatti per la crescita cellulare in quanto sono spesso porosi e permettono l&#39;interazione cellula-cellula e migrazione cellulare durante gli interstizi di un costrutto cellulare 3D 7. E &#39;importante monitorare la vitalità cellulare durante tl periodo di coltura e per garantire che la vitalità cellulare è mantenuta per tutto l&#39;arco del costrutto 3D. Ad esempio, condizioni di coltura come l&#39;ossigeno e pH richiedono un attento controllo, come gradienti di concentrazione di analiti possono esistere all&#39;interno del costrutto 3D. Bioreattori o sistemi di perfusione possono essere impiegati per simulare le condizioni in vivo di flusso interstiziale e come risultato un trasferimento incremento dei nutrienti e la rimozione metabolica rifiuti 8. La questione se tali sistemi sono garantire condizioni microambientali costanti può essere affrontato valutando il microambiente cellulare in tempo reale. Metriche chiave microambiente che possono essere monitorati in tempo reale le seguenti: temperatura, composizione chimica di supporti cellulari, concentrazione di ossigeno disciolto e anidride carbonica, pH e umidità. Di questi parametri, la temperatura può essere più facilmente monitorata utilizzando sonde in situ. Metodi per monitorare i restanti parametri di cui comunemente inrimozione volve di una aliquota di campionamento e quindi disturbare la coltura cellulare e aumentano il rischio di contaminazione. Si cercano continui, metodi in tempo reale. Metodi di controllo attuali di solito contare su strumenti che analizzano fisicamente il costrutto cellulare come un monitor pH o sonda ossigeno. Tuttavia, questi metodi intrusivi possono danneggiare il costrutto cellulare e disturbare l&#39;esperimento in corso. Monitoraggio non invasivo di concentrazioni dell&#39;analita all&#39;interno del costrutto 3D potrebbe consentire il monitoraggio in tempo reale di vari aspetti ambientali quali la riduzione dei nutrienti 9. Ciò consentirebbe di valutare apporto di sostanze nutritive alle regioni più profonde all&#39;interno della struttura e determinare se scorie metaboliche veniva eliminato in modo efficace 10,11. Sistemi che tentano di risolvere il problema di invasività genere comportano l&#39;uso di una camera di perfusione che passa mezzo di coltura sia attraverso il recipiente di coltura e ai sensori esterni per monitorare pH, ossigeno e glucosio 12. Ilre è crescente interesse nello sviluppo di sensori che possono essere integrati direttamente nel recipiente di coltura che non richiede la rimozione di una aliquota di campionamento e come tale sarebbe fornire monitoraggio in situ. Per affrontare tali carenze per in situ e monitoraggio non invasivo delle condizioni microambientali abbiamo incorporato analiti nanosensori reattivo in scaffolds elettrofilate per la produzione di ponteggi auto-segnalazione 13. Ponteggi che agiscono come dispositivi di rilevamento per il monitoraggio dell&#39;attività di fluorescenza sono stati preparati in precedenza, in cui il dispositivo di rilevamento era o scaffold polimerico effettivo creato da elettrospinning o attraverso l&#39;uso di un colorante reattivo analita che è incorporato nel polimero prima della formazione del ponteggio 14,15 . Tuttavia, questi dispositivi di rilevamento hanno il potenziale per dare uscite ottiche erronee causate da possibili interferenze di altri analiti. L&#39;uso di un dispositivo di rilevamento su raziometricoch come quelli preparati nel protocollo descritto ha il potenziale per eliminare questi possibili effetti negativi e fornire una risposta specifica per l&#39;analita in questione. I ponteggi elettrofilate qui presentati sono stati preparati dal sintetico co-polimero di poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA), selezionato a causa di avere Food and Drug Administration (FDA), grazie alle sue proprietà biodegradabili e biocompatibili ed una pista record di sostenere la crescita e la funzione dei vari tipi di cellule 16-18. Gli analiti raziometrico nanosensori reattivo pronti sono sensibili al pH. I nanosensori incorporano due coloranti fluorescenti in una matrice sol-gel biocompatibile in cui un colorante, FAM è sensibile al pH e l&#39;altra, TAMRA agisce come standard interno in quanto non è sensibile al pH. Inoltre la fluorescenza sia FAM e TAMRA può essere analizzata separatamente in quanto non si sovrappongono in modo significativo. Determinare il rapporto tra la emi fluorescenzaSsion di entrambi i coloranti a specifiche lunghezze d&#39;onda dà una risposta pH indipendente da altre condizioni ambientali. Le impalcature self-reporting potrebbero consentire la valutazione ripetizione del pH in situ e in tempo reale senza interrompere il modello 3D sviluppato. Abbiamo dimostrato che questi scaffold sono in grado di supportare attaccamento e la proliferazione cellulare e rimangono reattivo al analita in questione. La cinetica di acidi sottoprodotti di costrutti ingegnerizzati rimane poco studiato e come tale utilizzando i ponteggi reattive pH possono notevolmente facilitare tali studi 19. Inoltre, l&#39;uso dei ponteggi auto-segnalazione per applicazioni di ingegneria tissutale presenta l&#39;opportunità di comprendere appieno, monitorare e ottimizzare la crescita del modello 3d costrutti di tessuti in vitro, non invasivo e in tempo reale. I nanosensori reattiva di pH sono stati consegnati per l&#39;ambiente intracellulare di fibroblasti in coltura su electrospun PLGA ponteggiods. Il rapporto tra l&#39;emissione di fluorescenza dei coloranti sono stati utilizzati per monitorare pHi e rispetto ad un auto-segnalazione ponteggio Incorporando nanosensori pH. La consegna di nanosensori a cellule coltivate in un ambiente 3D potrebbe consentire il monitoraggio della concentrazione di analita in profondità all&#39;interno del costrutto in modo non distruttivo. Pertanto nanosensori possono essere uno strumento di imaging valida per valutare in modo non distruttivo il comportamento delle cellule in tutto 3D costruisce consentendo analisi a lungo termine. Screening della concentrazione dell&#39;analita di singole celle all&#39;interno di un costrutto 3D potrebbe assicurare che stanno ricevendo concentrazioni di nutrienti e di ossigeno sufficienti. Parametri di processo di monitoraggio potrebbe contribuire allo sviluppo di tecniche standardizzate per il trasporto di massa effettiva di ossigeno e nutrienti. La consegna dei nanosensori per l&#39;ambiente intracellulare e l&#39;incorporazione di nanosensori in scaffold polimerici potrebbe essere combinati per consentire la valutazione della vitalità cellulare così come la prestazione impalcatura all&#39;interno const 3Dructs durante il processo di crescita dei tessuti. Questo può portare ad un aumento della conoscenza di questi costrutti e progredire la realizzazione di sostituti del tessuto biologico pertinenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">32221</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Anhydrous dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">270547</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:137px;">35574</td>
			<td style="width:79px;">diluted to 30% (v/v) with pure water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">TEOS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">13190-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A3648</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1311</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1171</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate monobasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-0876</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaOH</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S8045</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T4174</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P0781</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D6046</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:137px;">Batch-213-101992</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G7513</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Optimem</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11058-021</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">LysoTracker Red</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">L-7528</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Draq5</td>
			<td style="width:71px;">Biostatus Ltd</td>
			<td style="width:137px;">DR50050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DCM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">320269</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">TFA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T6508</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="211">
			<td height="211" style="height:211px;width:195px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica TCS-SP</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">UV light</td>
			<td style="width:71px;">UVLS28 UVP, USA</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Stirrer plate</td>
			<td style="width:71px;">SB161-3 Jencons-PLS</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:71px;">Jenway model 3510</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:71px;">Buchi Rotary Evaporator R200</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Centrifuge (nanosensors)</td>
			<td style="width:71px;">Hermle Z300</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">Centrifuge (cell culture)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Whirlimixer Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Ultrasonicator</td>
			<td style="width:71px;">FB11021 Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Aluminum sheet</td>
			<td style="width:71px;">Nottingham University</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">35mm cell culture plate</td>
			<td style="width:71px;">Iwaki</td>
			<td style="width:137px;">3000035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">3T3 Fibroblast cells</td>
			<td style="width:71px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">PLGA</td>
			<td style="width:71px;">Lakeshore Biomaterials</td>
			<td>7525 DLG 7E</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pyridinium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P8535</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture

Celle di coltura in 3D su ponteggi adeguati è pensato per imitare al meglio il microambiente in vivo e aumentare le interazioni cellula-cellula. La risultante costrutto cellulare 3D può essere spesso più rilevante per studiare gli eventi molecolari e le interazioni cellula-cellula di esperimenti simili studiati in 2D. Per creare culture efficaci 3D con la vitalità delle cellule elevata in tutto il patibolo le condizioni di coltura come ossigeno e pH bisogno di essere attentamente controllata come gradienti di concentrazione di analiti possono esistere in tutto il costrutto 3D. Qui si descrivono i metodi di preparazione biocompatibili pH reattivo nanosensori sol-gel e la loro incorporazione in poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) ponteggi elettrofilate insieme a loro successiva preparazione per la coltura di cellule di mammifero. I ponteggi reattivo pH possono essere utilizzati come strumenti per determinare microambientali pH all&#39;interno di un costrutto cellulare 3D. Inoltre, tendiamo particolare la consegna di pH nanose reattivansors per l&#39;ambiente intracellulare di cellule di mammifero la cui crescita è stata sostenuta da elettrofilate scaffold PLGA. La posizione citoplasmatica dei nanosensori reattive pH può essere utilizzato per monitorare pH intracellulare (PHI) durante la sperimentazione in corso.

La distribuzione dimensionale delle pH nanosensori reattivi preparati è stata caratterizzata mediante SEM, dove la popolazione di nanosensori impressionate stati misurati e risultano avere dimensioni nanometriche nell&#39;intervallo 240-470 nm (Figura 1A). Il raggiungimento di un diametro ridotto e ragionevolmente piccolo è coerente con l&#39;utilizzo del metodo Stöber per preparare nanoparticelle. È stato trovato che utilizzando un ambiente basico pH durante la sintesi di nanoparticelle IE...

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Biocompatibili pH reattivo nanosensori sol-gel possono essere incorporati in poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) ponteggi elettrofilate. Le impalcature self-reporting prodotti possono essere utilizzati per il monitoraggio in situ delle condizioni microambientali mentre coltura di cellule sul patibolo. Questo è vantaggioso in quanto il costrutto cellulare 3D può essere monitorato in tempo reale senza disturbare l&#39;esperimento.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Research

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PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

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Preparazione del 3D fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali Cultura

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