Name: self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2013-11-07T19:15:00
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O financiamento do BBSRC é gentilmente reconhecida (número de concessão BB H011293 / 1).

Visão global Secção 1 descreve a preparação de pH nanosensors reactivos e caracterização da resposta nanosensor para pH usando espectrometria de fluorescência e o seu tamanho usando SEM. Seção 2 descreve a preparação de suportes poliméricos electrospun e caracterização da sua morfologia e tamanho utilizando SEM. Seção 2 também descreve a preparação de andaimes de auto-relato que são andaimes electrospun com a inclusão dos pH nanosensors respons...

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	<li>Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+liver+tissue+formation+in+rats+using+a+novel+collagen-polypropylene+scaffold.">De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold.</a> Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).</li><li>Sales, V. L., Engelmayr, G. 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A engenharia de tecidos aspira para criar substitutos biológicos que podem ser utilizados tanto in vivo como in vitro como em modelos de tecido e em terapia de substituição de tecido para substituição, reparação, manter ou melhorar a função de um tecido ou órgão específico. Substitutos sintéticos têm sido usados ​​por muitos anos para substituir ou reparar ajuda de tecidos, mas estes muitas vezes não conseguem devido à falta de integração com o tecido e / ou infecção do...

Uma estratégia chave na engenharia de tecidos é o uso de materiais biocompatíveis para o fabrico de andaimes, cuja morfologia se assemelha ao tecido que vai substituir e também é capaz de suportar o crescimento e função das células de 1,2. O andaime proporciona suporte mecânico permitindo adesão e proliferação de células ainda permite a migração de células ao longo dos interstícios de uma construção celular 3D. O andaime também deve permitir o transporte de massa de nutrientes celulares e não inibir a remoção de resíduos metabólicos 3. Eletrofiação emergiu como um método promissor para a fabricação de suportes poliméricos capazes de suportar o crescimento celular 4-6. As fibras não tecidas electrospun produzidos são adequados para o crescimento celular, como eles são muitas vezes poroso e permitir a interacção célula-célula, assim como a migração de células ao longo dos interstícios de uma construção celular 3D 7. É importante monitorar a viabilidade celular durante tele período de cultura e para assegurar que a viabilidade celular é mantido ao longo de todo o construto 3D. Por exemplo, as condições de cultura, tais como o oxigénio e requerem um controlo cuidadoso do pH, como os gradientes de concentração do analito pode existir dentro da construção 3D. Ou sistemas de biorreactores de perfusão podem ser empregues para mimetizar as condições in vivo de fluxo intersticial e, como um resultado de transferência de aumento de nutrientes e remoção de resíduos metabólicos 8. A questão de saber se tais sistemas estão garantindo condições do microambiente constantes podem ser abordadas por meio da avaliação do microambiente celular em tempo real. Microambiente métricas-chave que poderiam ser monitorados em tempo real incluem: temperatura, composição química dos meios de comunicação de células, a concentração de oxigênio dissolvido e dióxido de carbono, pH e umidade. Dessas métricas, a temperatura pode ser mais facilmente controlada por meio de sondas in situ. Os métodos para monitorar os restantes métricas listadas comumente emvolve a remoção de uma aliquota para a amostragem e, por conseguinte, perturbar a cultura de células e aumentam o risco de contaminação. , Métodos contínua em tempo real estão sendo procurados. Métodos de monitoramento atuais geralmente dependem de instrumentos que verificam fisicamente a construção celular, como um monitor ou sonda pH oxigênio. No entanto, estes métodos invasivos podem danificar a construção celular e perturbar a experiência em curso. Monitoramento não invasivo de concentrações de analito dentro da construção 3D poderia permitir o monitoramento em tempo real de vários aspectos ambientais, tais como esgotamento de nutrientes 9. Isso permitiria que a avaliação de fornecimento de nutrientes para as regiões mais profundas na estrutura e determinar se os resíduos metabólicos estava sendo removido de forma eficaz 10,11. Os sistemas que tentam resolver o problema da capacidade de invasão envolvem geralmente a utilização de uma câmara de perfusão que passa através do meio de cultura, tanto o vaso de cultura e para sensores externos, para monitorar o pH, o oxigénio e glicose, 12. ORe é um interesse crescente no desenvolvimento de sensores que podem ser directamente integrados no vaso de cultura, que não exigem a remoção de uma aliquota para a amostragem e, como tal, poderia prever na monitorização in situ. Para lidar com essas deficiências para in situ e monitoramento não invasivo das condições do microambiente que incorporaram analitos nanosensors responsivos em andaimes electrospun para produzir auto-relato andaimes 13. Os andaimes que actuam como dispositivos de detecção por monitorização da actividade de fluorescência foram preparados anteriormente, em que o dispositivo de detecção era ou o andaime polimérico real criado por electrospinning, ou através do uso de um corante sensível analito que é incorporada no polímero antes da formação do andaime 14,15 . No entanto, estes dispositivos sensores têm o potencial para se obter saídas ópticas erróneos causados ​​pela possível interferência de outros analitos. O uso de um dispositivo de detecção de medida proporcional such como os que são preparados no protocolo descrito tem o potencial de eliminar estes efeitos adversos possíveis e fornecer uma resposta específica para o analito em questão. Os andaimes electrospun aqui apresentados foram preparados a partir da poli-co-polímero sintético (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), escolhido devido a ter a Food and Drug Administration aprovação (FDA), devido às suas propriedades biodegradáveis ​​e biocompatíveis e uma faixa ficha de suporte do crescimento e função de vários tipos de células 16-18. Os analitos raciométrica nanosensors responsivos preparados são sensíveis ao pH. Os nanosensors incorporar dois corantes fluorescentes numa matriz de sol-gel biocompatível, onde um corante, FAM é sensível ao pH e o outro, TAMRA actua como um padrão interno, uma vez que não é sensível ao pH. Além disso, a fluorescência de ambos FAM e TAMRA podem ser analisados ​​separadamente uma vez que não se sobrepõem. A determinação da relação da emi fluorescênciassion de ambos os corantes em comprimentos de onda específicos dá uma resposta independente do pH de outras condições ambientais. Os andaimes de auto-relato pode permitir a avaliação da repetição do pH in situ e em tempo real, sem perturbar o modelo 3D desenvolvido. Demonstrou-se que estes suportes são capazes de suportar fixação e proliferação celular e permanecer sensível ao analito em questão. A cinética de ácido subprodutos em construções projetadas permanece pouco estudado e, como tal, utilizando o pH andaimes responsivos poderia facilitar muito os estudos 19. Além disso, o uso dos andaimes de auto-relato para aplicações em engenharia de tecidos apresenta a oportunidade de compreender, monitorar e otimizar o crescimento do modelo 3D construções de tecidos in vitro, de forma não invasiva e em tempo real. Os pH nanosensors responsivos também foram entregues para o meio intracelular de fibroblastos cultivados sobre electrospun scaffol PLGAds. A proporção da emissão de fluorescência a partir dos corantes foram utilizados para monitorizar o pHi e comparado com um auto-relato de andaime integrem nanosensors pH. A entrega de nanosensores para as células cultivadas em um ambiente 3D poderia permitir o monitoramento da concentração de analito de profundidade dentro da construção de uma forma não destrutiva. Portanto nanosensors pode ser uma ferramenta de imagem viável para avaliar o comportamento das células de modo não destrutivo ao longo 3D constrói permitindo a análise de longo prazo. Rastreio a concentração do analito de células individuais dentro de uma construção em 3D poderia garantir que eles estão recebendo as concentrações de nutrientes e oxigênio suficientes. Parâmetros do processo de acompanhamento pode ajudar no desenvolvimento de técnicas padronizadas para o transporte de massa eficiente de oxigênio e nutrientes. A entrega de nanosensores para o meio intracelular e incorporação de nano-sensores em scaffolds poliméricos podem ser combinadas para permitir a avaliação da viabilidade das células, bem como o desempenho de andaime dentro de const 3Dructs durante o processo de crescimento do tecido. Isso pode levar a um maior conhecimento dessas construções e progredir a fabricação de substitutos de tecido biologicamente relevantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">32221</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Anhydrous dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">270547</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:137px;">35574</td>
			<td style="width:79px;">diluted to 30% (v/v) with pure water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">TEOS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">13190-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A3648</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1311</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1171</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate monobasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-0876</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaOH</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S8045</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T4174</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P0781</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D6046</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:137px;">Batch-213-101992</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G7513</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Optimem</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11058-021</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">LysoTracker Red</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">L-7528</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Draq5</td>
			<td style="width:71px;">Biostatus Ltd</td>
			<td style="width:137px;">DR50050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DCM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">320269</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">TFA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T6508</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="211">
			<td height="211" style="height:211px;width:195px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica TCS-SP</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">UV light</td>
			<td style="width:71px;">UVLS28 UVP, USA</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Stirrer plate</td>
			<td style="width:71px;">SB161-3 Jencons-PLS</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:71px;">Jenway model 3510</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:71px;">Buchi Rotary Evaporator R200</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Centrifuge (nanosensors)</td>
			<td style="width:71px;">Hermle Z300</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">Centrifuge (cell culture)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Whirlimixer Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Ultrasonicator</td>
			<td style="width:71px;">FB11021 Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Aluminum sheet</td>
			<td style="width:71px;">Nottingham University</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">35mm cell culture plate</td>
			<td style="width:71px;">Iwaki</td>
			<td style="width:137px;">3000035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">3T3 Fibroblast cells</td>
			<td style="width:71px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">PLGA</td>
			<td style="width:71px;">Lakeshore Biomaterials</td>
			<td>7525 DLG 7E</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pyridinium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P8535</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture

Células de cultivo em 3D no andaimes apropriados é pensado para melhor imitar o vivo microambiente e aumentar as interações célula-célula. A construção celular 3D, resultando muitas vezes pode ser mais relevante para estudar os eventos moleculares e interações célula-célula que experimentos semelhantes estudados em 2D. Para criar culturas 3D eficazes com alta viabilidade celular ao longo do andaime as condições de cultura, tais como o oxigénio e necessidade de pH deve ser cuidadosamente controlada de gradientes de concentração do analito pode existir em todo o construto 3D. Descrevemos aqui os métodos de preparação de pH responsivos nanosensors sol-gel biocompatíveis e a sua incorporação em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun juntamente com a sua preparação posterior para a cultura de células de mamíferos. Os andaimes de pH reagir podem ser utilizados como ferramentas para determinar microambiental pH dentro de uma construção celular 3D. Além disso, detalhamos a entrega de pH nanose responsivonsors para o ambiente intracelular de células de mamíferos, cujo crescimento foi suportado por suportes de PLGA electrospun. A localização citoplasmática do pH nanosensors responsivo pode ser utilizado para monitorar o pH intracelular (pHi) durante a experimentação contínua.

A distribuição do tamanho das pH nanosensors responsivos preparadas foi caracterizado utilizando SEM, onde a população de nanosensors fotografados foram medidos e verificou-se ter dimensões nanométricas na gama de 240-470 nm (Figura 1A). A realização de um diâmetro estreito e razoavelmente pequeno é consistente com o uso do método de Stöber para preparar nanopartículas. Verificou-se que utilizando um ambiente de pH básico durante a síntese de nanopartículas ou seja nanopartícul...

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Biocompatíveis pH responsivos nanosensors sol-gel pode ser incorporado em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun. Os andaimes de auto-relato produzidos podem ser utilizados para a monitorização in situ de condições micro-ambientais, enquanto a cultura de células sobre o andaime. Isto é benéfico porque a construção celular 3D pode ser monitorado em tempo real, sem perturbar o experimento.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Research

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