Name: isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 5KO8DK085136-02 لJY.

1. الحصول على الأنسجة القولون فأر بروتوكول لأداء التجارب على الحيوانات، تبين بالتفصيل المنطقي وأهداف البحث، وقدمت والتي وافق عليها مكتب المؤسسية لدينا الحيوان بحوث الرقابة. <ol style=";text-align:right;di...

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li><li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line.">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li><li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

تقنية عامة مشابهة عند استخدام إما الماوس أو القولون الإنسان. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لعزل myofibroblasts من الأمعاء الدقيقة. تفاصيل محددة لعزل myofibroblasts من 1. الماوس و 2. وتناقش القولون البشري أدناه. 1. الماوس القولون <p class="jove_content" s...

تنظيم الجهاز الهضمي (GI) وظيفة الجهاز ينطوي المعقدة، والتفاعلات الدينامية بين الطبقة المخاطية واللحمة المتوسطة الكامنة. هذه التفاعلات تخدم عادة للحفاظ على التوازن ولكن قد يؤدي أيضا إلى تطوير الحالات المرضية في ظل ظروف مرضية 1. Myofibroblasts هي جزء من السكان من الخلايا اللحمية تقع تحتاني إلى الطبقة الظهارية التي تتصل بطريقة نظير الصماوي مع توضيح المجموعات السكانية الفرعية خلية لتنظيم عدد من العمليات الحرجة الجهاز الهضمي والتي تشمل تجديد الغشاء المخاطي، والإصلاح، والتليف 2. خط الخلية 18Co هو مثال على القولون خط الخلية البشرية الأرومة الليفية العضلية التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة وظيفة الأرومة الليفية العضلية لأنها تشترك في كثير من الخصائص من التعليم الابتدائي في myofibroblasts الموقع. وتشمل هذه تعبير البروتين من العضلات على نحو سلس الأكتين (α-SMA) وvimentin، فضلا عن التعبير عن عددمن مستقبلات سطح الخلية مثل مستقبلات عامل نمو البشرة، أو مستقبلات حمض 3،4 lysophosphatidic. بسبب هذه الخصائص التركيبية المشتركة، فضلا عن التشابه في وظيفة بيولوجية 5، وقد استخدم خط الخلية 18Co على نطاق واسع لدراسة وظيفة الأرومة الليفية العضلية في سياق العديد من الحالات المرضية مثل مرض التهاب الأمعاء أو القولون والمستقيم 3،6 السرطان. ومع ذلك، هناك قيود والمخاوف المتأصلة عند استخدام خط الخلية. وتشمل هذه عدم الاستقرار الوراثي بمرور الوقت التي تميز خطوط الخلايا من الخلايا الأولية، وتغيير النمط الظاهري وظيفة بيولوجية الخلية، بما في ذلك معدلات النمو والتفاعل مع السكان الخلية الأخرى. تفتقر خطوط الخلايا أيضا مكونات طبيعية من المكروية GI (الظهارية، اللحمية، ومكونات الأوعية الدموية)، والذي يشكل قيدا رئيسيا لاستخدامه. وبالتالي، فإن الاستنتاجات المستخلصة من البحوث التجريبية خط الخلية يتطلب مزيدا من التحقق من صحة للحد من ريكورونا من سوء التفسير. ويمكن الحصول على myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان والفأر لتأكيد النتائج التجريبية التي تم تحديدها في خط الخلية 7. طريقة وصفت في الأصل من قبل Mahida، وآخرون. 8، وبروتوكول لدينا هي واحدة من العديد من التقنيات موصوفة وصفا جيدا والتي يمكن استخدامها لعزل myofibroblasts الأولية من الماوس والقولون الإنسان 9. عن أي نموذج الفأر من مرض القولون، هذه التقنية يمكن استخدامها لعزل myofibroblasts الأولية لدراسة كيفية تفاعلها مع الخلايا المجاورة أو المساهمة في الظروف العادية أو عمليات GI مرضية 10،11. هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة كيفية مساهمة myofibroblasts إلى المخاطية الشفاء، والتليف، وتطوير أورام القولون والمستقيم وسرطان. كما يمكن الحصول على myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان التي تم مقطوعة في وقت التشغيل لحميدة (مرض التهاب الأمعاء، والقيود، انسدادات) أو ج الخبيثةonditions. يمكن زراعتها الخلايا الأولية المعزولة من أنسجة القولون الإنسان والفأر في المزارع الخلوية والاستفادة منها على عدد محدود من المقاطع.

Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase I</td>
 <td>Invitrogen/GIBCO</td>
 <td>#17105-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche</td>
 <td>#1 088 858</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>#14-825-16K</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

والأرومة الليفية العضلية هي خلايا انسجة الجهاز الهضمي من (GI) المسالك التي تم تكتسب اهتماما كبيرا لدورها الحاسم في كثير من وظائف الجهاز الهضمي. في حين أن العديد من خطوط الخلايا الأرومة الليفية العضلية المتاحة تجاريا لدراسة هذه الخلايا في المختبر، ونتائج البحوث من خط الخلية تتعرض لظروف تجريبية ثقافة الخلية على قيود متأصلة نظرا لطبيعة اختزالية بشكل مفرط من العمل. استخدام myofibroblasts الأولية يقدم ميزة كبيرة من حيث تؤكد النتائج التجريبية التي تم تحديدها في خط الخلية. عزل myofibroblasts الأولية من نموذج حيواني يسمح لدراسة myofibroblasts ظل الظروف التي تحاكي بشكل وثيق الدولة الأمراض التي تجري دراستها. عزل myofibroblasts الأولية من الأنسجة القولون الإنسان يوفر يمكن القول إن معظم البيانات التجريبية ذات الصلة، منذ الخلايا تأتي مباشرة من المرضى الذين يعانون من هذا المرض الأساسي. نحن تصف تقنية راسخة يمكن أن تكون شtilized لعزل myofibroblasts الأساسي من كلا الماوس والأنسجة القولون الإنسان. وقد اتسمت هذه الخلايا أن تكون معزولة أكتين ألفا العضلات الملساء وvimentin إيجابية، وdesmin السلبية، بما يتفق مع myofibroblasts المعوية تحت الظهارة. يمكن زراعتها خلايا الأرومة الليفية العضلية الأولية في خلية ثقافة وتستخدم لأغراض تجريبية على عدد محدود من المقاطع.

مرة واحدة معزولة، myofibroblasts الإنسان الأساسية يمكن زراعتها في خلية ثقافة وتستخدم أكثر من عدد محدود من المقاطع (حتى مرور 4). وتتميز هذه الخلايا بأنها على نحو سلس أكتين العضلات وvimentin إيجابية، وسلبية desmin (الشكل 1A)، بما يتفق مع myofibroblasts تحت الظهارة المعوية 5،7. ل...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

والأرومة الليفية العضلية هي الخلية اللحمية تأثيرا في الجهاز الهضمي الذي ينظم العمليات الفسيولوجية الهامة في الدول العادية والمرض. نحن تصف تقنية تسمح لعزل myofibroblasts الأساسي من كلا الماوس والأنسجة القولون الإنسان، والتي يمكن استخدامها في المختبر لالتجريب.

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

عزل Myofibroblasts من الفأر والمرئ الإنسان

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...