Name: isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant 5KO8DK085136-02 til JY.

1.. Opnå tyktarmsvæv Mus En protokol til at udføre dyreforsøg, beskriver rationalet og målsætninger for forskning, blev forelagt og godkendt af vores institutionelle Office of Animal Research Oversight. <ol><li> Aflive mus med inhaleret isofluran efterfulgt af cervikal dislokation. </li><li> Lav en ventral midtlinjeincision, trække tyndtarmen væk og identificere tyktarmen. Træk blæren og livmoderen (hvis tilstede) sideværts og identificere skambenet og ...

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li><li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line.">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li><li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

Den generelle teknik er den samme ved brug af enten mus eller human colon. Denne teknik kan også anvendes til at isolere myofibroblasts fra tyndtarmen. Specifikke detaljer til isolering af myofibroblasts fra 1.. mus og 2. human colon er beskrevet nedenfor. 1.. Mus Colon Vanding af muse colon lettes ved at fastgøre en 4, 16 G Popper stumpendede nålen til den ene ende af tyktarmen. Det hjælper også, når tyktarmen skæring i længderetningen. Du kan harmonika tyk...

Reguleringen af ​​gastrointestinal (GI) tarmkanalen funktion involverer komplekse og dynamiske samspil mellem slimhinde lag og dens underliggende mesenchyme. Disse interaktioner normalt tjener til at opretholde homøostase, men kan også føre til udvikling af sygdomstilstande under patologiske tilstande 1. Myofibroblasts er en subpopulation af stromaceller placeret underliggende den epithellaget at kommunikere på en parakrin måde med omgivende cellesubpopulationer at regulere en række kritiske mavetarmkanalen processer, der inkluderer mucosal regenerering, reparation og fibrose 2. Den 18Co cellelinie er et eksempel på en human colon myofibroblastlignende cellelinie, som er blevet bredt anvendt til at undersøge myofibroblastlignende funktion, fordi den deler mange af kendetegnene ved primær in situ myofibroblasts. Heriblandt protein ekspression af a-glat muskulatur actin (α-SMA) og vimentin, såvel som ekspressionen af ​​en rækkeaf celleoverfladereceptorer, såsom den epidermale vækstfaktor receptor eller receptorer for lysophosphatidsyre 3,4. På grund af disse delte ultrastrukturelle karakteristika, samt ligheder i biologisk funktion 5 har 18Co cellelinie vid udstrækning blevet anvendt til at studere myofibroblastlignende funktion i forbindelse med mange sygdomstilstande, såsom inflammatorisk tarmsygdom eller kolorektal cancer 3,6. Der er imidlertid iboende begrænsninger og problemer ved brug af en cellelinie. Disse omfatter genotypisk ustabilitet over tid, der adskiller cellelinier fra primære celler, ændring af fænotype og biologiske funktion af cellen, herunder vækstrater og interaktioner med andre cellepopulationer. Cellelinier også mangle de normale bestanddele af GI mikromiljø (epitelial, stromal og vaskulære komponenter), som er en vigtig begrænsning for dens anvendelse. Derfor konklusionerne fra eksperimentel cellelinje forskning kræver yderligere validering for at reducere risk for fejlfortolkning. Primære myofibroblasts kan fås fra mennesker og mus tyktarmsvæv at bekræfte eksperimentelle resultater identificeret i en celle linje 7. Metoden blev oprindeligt beskrevet af Mahida et al. 8 og vores protokol er en af mange velbeskrevne teknikker, der kan anvendes til isolering primære myofibroblasts fra muse og human colon 9. For enhver musemodel af colon sygdom, kan denne teknik bruges til at isolere primære myofibroblasts at studere, hvordan de interagerer med de omkringliggende celler eller bidrage til både normal eller patologisk GI processer 10,11. Denne teknik kan anvendes til at undersøge, hvordan myofibroblasts bidrage til mucosale healing, fibrose og udviklingen af ​​colorektale adenomer og karcinomer. Primære myofibroblasts kan også fås fra human colon væv, der er blevet resekteret på tidspunktet for operation for godartede (inflammatorisk tarmsygdom, strikturer, diverticulitis) eller ondartet cETINGELSER. Isolerede primære celler fra mennesker og mus tyktarmsvæv kan dyrkes i cellekultur og anvendt i løbet af et begrænset antal passager.

Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase I</td>
 <td>Invitrogen/GIBCO</td>
 <td>#17105-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche</td>
 <td>#1 088 858</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>#14-825-16K</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

Den myofibroblastlignende er en stromal celle i den gastrointestinale (GI) kanal, der har vundet betydelig opmærksomhed for sin afgørende rolle i mange GI funktioner. Mens flere myofibroblastlignende cellelinjer er kommercielt tilgængelige til at studere disse celler in vitro, forskningsresultater fra en cellelinje udsættes for eksperimentel cellekultur betingelser har iboende begrænsninger på grund af den alt for reduktionistisk arbejdets art. Anvendelse af primære myofibroblasts giver en stor fordel i form af bekræftelse eksperimentelle resultater identificeret i en cellelinie. Isolering af primære myofibroblasts fra en dyremodel giver mulighed for undersøgelse af myofibroblaster under betingelser, som i højere grad efterligner den sygdomstilstand, der undersøges. Isolering af primære myofibroblasts fra human colon væv giver velsagtens de mest relevante eksperimentelle data, da cellerne kommer direkte fra patienter med den underliggende sygdom. Vi beskriver en veletableret teknik, som kan være utilized at isolere primære myofibroblasts fra både mus og human colon væv. Disse isolerede celler er blevet karakteriseret for at være alpha-glatmuskel-actin og vimentin-positive, og desmin-negative i overensstemmelse med subepithelial intestinale myofibroblasts. Primære myofibroblastlignende celler kan dyrkes i cellekultur og anvendes til forsøgsformål over et begrænset antal passager.

Når isolerede, kan primære humane myofibroblasts dyrkes i cellekultur og anvendes over et begrænset antal passager (op til passagen 4). Disse celler er kendetegnet ved at være a-glat muskel-actin og vimentin positive, og desmin-negative (figur 1A), i overensstemmelse med intestinal subepithelial myofibroblasts 5,7. De har også en karakteristisk stjerneformet morfologi (figur 1B). Primære myofibroblasts kan derefter anvendes til at bekræfte eksperimentelle resultater er...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Den myofibroblastlignende er en indflydelsesrig stromacellen af ​​mave-tarmkanalen, der regulerer vigtige fysiologiske processer i både normale og sygdomstilstande. Vi beskriver en teknik, der giver mulighed for isolering af primære myofibroblasts fra både mus og human colon væv, som kan anvendes til in vitro-eksperimenter.

Isolering af Primære myofibroblasts fra mus og Human tyktarmsvæv

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive voksne stamceller Isolering fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA Isolation fra Mouse Pancreas: en ribonuklease-rige væv

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering og funktionel analyse af mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering af myofibroblaster fra mus og human Spiserøret

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur af primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Isolation og karakterisering af voksne hjertefibroblaster og Myofibroblaster

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...