Name: isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant 5KO8DK085136-02 a JY.

1. Ottenere Colon Tissue Mouse Un protocollo per eseguire esperimenti su animali, specificando le motivazioni e gli obiettivi della ricerca, è stato presentato e approvato dal nostro ufficio istituzionale di Animal Research Vigilanza. <ol><li> Euthanize il mouse con isoflurano inalato seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Effettuare una incisione mediana ventrale, ritrarre il piccolo intestino di distanza e identificare il colon. Ritrarre la vescica e dell...

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. 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Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

La tecnica generale è simile usando il mouse o colon umano. Questa tecnica può essere utilizzata per isolare miofibroblasti dal piccolo intestino. I dettagli specifici per l&#39;isolamento dei miofibroblasti da 1. mouse e 2. colon umano sono discussi di seguito. 1. Topo Colon Irrigazione del colon mouse viene facilitata collegando un 4, 16 G Popper ago smussato-end a un&#39;estremità del colon. Questo aiuta anche durante il taglio del colon longitudinalmente. È ...

La regolazione della funzione gastrointestinale del tratto (GI) comporta complesse, interazioni dinamiche tra lo strato mucoso e il suo mesenchima sottostante. Queste interazioni normalmente servono a mantenere l&#39;omeostasi ma possono anche portare allo sviluppo di stati di malattia in condizioni patologiche 1. Miofibroblasti sono una sottopopolazione di cellule stromali situati soggiacente allo strato epiteliale che comunicano in modo paracrino con circostante sottopopolazioni di cellule per regolare un numero di processi tratto GI critici che includono rigenerazione della mucosa, riparazione e fibrosi 2. La linea cellulare 18Co è un esempio di una linea umana colon miofibroblasti cella che è stato ampiamente utilizzato per studiare la funzione miofibroblasti perché condivide molte delle caratteristiche di primaria in miofibroblasti situ. Questi includono l&#39;espressione della proteina di a-actina muscolare liscia (α-SMA) e vimentina, nonché l&#39;espressione di un numerodei recettori di superficie cellulare, come il recettore del fattore di crescita epidermico, o recettori per 3,4 acido lysophosphatidic. A causa di queste caratteristiche ultrastrutturali condivisi, nonché similitudini nella funzione biologica 5, la linea cellulare 18Co è stato ampiamente utilizzato per studiare la funzione miofibroblasti nel contesto di molti stati patologici quali la malattia infiammatoria intestinale o colorettale 3,6 cancro. Tuttavia, vi sono limitazioni intrinseche e preoccupazioni quando si utilizza una linea cellulare. Questi includono instabilità genotipica nel tempo che differenzia linee cellulari di cellule primarie, alterando il fenotipo e funzione biologica della cellula, compresi tassi di crescita e le interazioni con altre popolazioni cellulari. Linee cellulari mancano anche i normali componenti del microambiente GI (epiteliale, stromale e componenti vascolari), che è un importante limitazione al suo uso. Pertanto, le conclusioni tratte dalla ricerca sperimentale linea cellulare richiede un&#39;ulteriore conferma per ridurre il risk di errori di interpretazione. Miofibroblasti primari possono essere ottenuti da colon tessuto umano e il mouse per confermare i risultati sperimentali individuati in una linea cellulare 7. Il metodo è stato originariamente descritto da Mahida, et al. 8, e il protocollo è una delle molte tecniche ben definite che possono essere utilizzati per isolare miofibroblasti primari di topo e del colon umano 9. Per ogni modello murino della malattia del colon, questa tecnica può essere utilizzata per isolare myofibroblasts primarie per studiare come interagiscono con le cellule vicine o contribuire sia normale o patologico GI elabora 10,11. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare come miofibroblasti contribuiscono alla guarigione della mucosa, fibrosi, e lo sviluppo di adenomi e carcinomi colorettali. Miofibroblasti base possono anche essere ottenuti da tessuti del colon umano che è stato asportato al momento della operazione per benigna (malattia infiammatoria intestinale, stenosi, diverticolite) o maligni condizioni. Cellule primarie isolate da tessuti umani colon e mouse possono essere coltivate in coltura cellulare ed utilizzati per un numero limitato di passaggi.

Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase I</td>
 <td>Invitrogen/GIBCO</td>
 <td>#17105-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche</td>
 <td>#1 088 858</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>#14-825-16K</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

Il miofibroblasti è una cellula stromale del tratto che sta guadagnando una notevole attenzione per il suo ruolo fondamentale in molte funzioni GI gastrointestinale (GI). Mentre diverse linee cellulari miofibroblasti sono disponibili in commercio per studiare queste cellule in vitro, i risultati della ricerca di una linea di cellule esposte a condizioni di coltura cellulare sperimentali hanno delle limitazioni intrinseche dovute al carattere eccessivamente riduttiva del lavoro. L&#39;uso di miofibroblasti primarie offre un grande vantaggio in termini di conferma risultati sperimentali individuati in una linea cellulare. Isolamento di miofibroblasti primarie da un modello animale consente lo studio dei miofibroblasti in condizioni che imitare maggiormente lo stato di malattia in fase di studio. Isolamento di miofibroblasti primari dal tessuto del colon umano fornisce senza dubbio i dati sperimentali più rilevanti, dal momento che le cellule provengono direttamente dai pazienti con la malattia di base. Descriviamo una tecnica ben consolidata che può essere utilized isolare myofibroblasts primarie sia da mouse e tessuti del colon umano. Queste cellule isolate sono stati caratterizzati per essere alfa-actina del muscolo liscio e vimentina-positive, e desmina-negativo, in linea con miofibroblasti intestinali subepiteliali. Cellule myofibroblast primarie possono essere coltivate in coltura cellulare e utilizzati per scopi sperimentali su un numero limitato di passaggi.

Una volta isolato, miofibroblasti umani primari possono essere coltivate in coltura cellulare ed utilizzati per un numero limitato di passaggi (fino a passaggio 4). Queste cellule sono caratterizzate come un liscio-actina muscolare e vimentina positivo, e desmin-negativi (Figura 1A), in linea con intestinali myofibroblasts subepiteliali 5,7. Essi hanno anche una caratteristica stellato morfologia (Figura 1B). Miofibroblasti primari possono poi essere utilizzati per confermare...

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Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Il miofibroblasti è una cellula stromale influente del tratto gastrointestinale che regola importanti processi fisiologici in stati normali e patologici. Descriviamo una tecnica che consente l&#39;isolamento dei miofibroblasti primarie sia da mouse e tessuti del colon umano, che può essere utilizzato per la sperimentazione in vitro.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

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