Name: isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant 5KO8DK085136-02 a JY.

1. Obter Colon Tissue Mouse Um protocolo para realizar experimentos com animais, detalhando os fundamentos e objetivos da pesquisa, foi submetido e aprovado pelo nosso Departamento de Pesquisa institucional Supervisão Animal. <ol><li> Eutanásia o mouse com isoflurano inalado seguido por deslocamento cervical. </li><li> Faça uma incisão na linha média ventral, retraia o intestino delgado de distância e identificar o cólon. Recolha a bexiga e o útero (se pre...

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li><li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line.">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li><li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

A técnica geral é semelhante ao usar o mouse ou o cólon humano. Esta técnica também pode ser usada para isolar os miofibroblastos do intestino delgado. Detalhes específicos para o isolamento de miofibroblastos de 1. rato e 2. cólon humano são discutidos abaixo. 1. Rato Colon Irrigação do cólon do rato é facilitada pela fixação de um 4 em 16 L Popper agulha de extremidades cegas para uma das extremidades do cólon. Isso também ajuda quando o corte do c...

A regulação da função do trato gastrointestinal (GI), envolve interações dinâmicas complexas entre a camada mucosa e seu mesênquima subjacente. Estas interacções normalmente servem para manter a homeostase, mas também pode levar ao desenvolvimento de estados de doença, em condições patológicas 1. Os miofibroblastos são uma subpopulação de células estromais localizados subjacente à camada epitelial que comunicar de uma forma parácrina com áreas subpopulações de células para regular um número de processos críticos do tracto GI que incluem regeneração das mucosas, reparação, e fibrose 2. A linha celular de 18Co é um exemplo de uma linha celular humana do cólon miofibroblastos que tem sido amplamente utilizado para estudar a função de miofibroblastos porque partilha muitas das características de primário em miofibroblastos situ. Estes incluem a expressão de proteínas de um-actina de músculo liso (α-SMA) e vimentina, bem como a expressão de uma sériede receptores de superfície celular, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico, ou receptores de 3,4 ácido lisofosfatídico. Devido a estas características ultra-estruturais comuns, bem como similaridades na função biológica 5, a linha de células de 18Co tem sido amplamente utilizado para estudar a função de miofibroblastos no contexto de muitos estados de doença, tais como a doença inflamatória do intestino ou 3,6 cancro colorectal. No entanto, existem limitações inerentes e preocupações na utilização de uma linha celular. Estes incluem a instabilidade genotípica ao longo do tempo que diferencia as linhas celulares a partir de células primárias, alterando o fenótipo e função biológica da célula, incluindo as taxas de crescimento e as interacções com outras populações de células. As linhas celulares também não possuem os componentes normais do microambiente GI (epitelial, estromal, e componentes vasculares), que é uma limitação importante à sua utilização. Portanto, as conclusões da pesquisa linhagem celular experimental requer uma validação adicional para reduzir o risk de má interpretação. Miofibroblastos primárias podem ser obtidas a partir de tecido de cólon humano e de ratinho para confirmar os resultados experimentais identificados em uma linha de células 7. O método foi descrito originalmente por Mahida et al. 8, e o nosso protocolo é uma das várias técnicas bem definidas que podem ser utilizadas para isolar os miofibroblastos primários de ratinho e de cólon humano 9. Para qualquer modelo do rato da doença colônica, esta técnica pode ser usada para isolar myofibroblasts principais para estudar a forma como eles interagem com as células vizinhas ou contribuir para tanto normal ou patológica GI processa 10,11. Esta técnica pode ser usada para estudar como miofibroblastos contribuir para a cicatrização da mucosa, fibrose, e o desenvolvimento de adenomas e carcinomas. Miofibroblastos primárias também pode ser obtido a partir de tecido de cólon humano que foi ressecado, no momento da operação de benigna (doença inflamatória do intestino, estenoses, diverticulite) ou maligno cCONDIÇÕES. As células primárias isoladas a partir de tecido de cólon humano e de ratinho podem ser cultivadas em cultura celular e utilizada ao longo de um número limitado de passagens.

Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase I</td>
 <td>Invitrogen/GIBCO</td>
 <td>#17105-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche</td>
 <td>#1 088 858</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>#14-825-16K</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

O miofibroblastos é uma célula estromal do tracto gastrointestinal (GI) que tem vindo a ganhar uma atenção considerável para o seu papel fundamental em muitas funções gastrointestinais. Enquanto várias linhas de células de miofibroblastos são comercialmente disponíveis para estudar estas células in vitro, os resultados da pesquisa de uma linha de células expostas a condições de cultura de células experimentais têm limitações inerentes devido à natureza excessivamente redutora do trabalho. Utilização de miofibroblastos primárias oferece uma grande vantagem em termos de resultados experimentais, confirmando identificados numa linha celular. Isolamento de miofibroblastos primárias a partir de um modelo animal, permite o estudo dos miofibroblastos, em condições que mais de perto simulam o estado da doença a ser estudada. Isolamento de miofibroblastos primários de tecido do cólon humano oferece, sem dúvida, os dados experimentais mais relevantes, uma vez que as células vêm diretamente de pacientes com a doença de base. Nós descrevemos uma técnica bem estabelecida, que pode ser utilized isolar myofibroblasts primários do mouse e do tecido do cólon humano. Estas células isoladas foram caracterizadas como actina alfa de músculo liso e vimentina-positivas, e desmina-negativos, de acordo com miofibroblastos subepiteliais intestinais. Células de miofibroblastos primárias podem ser cultivadas em cultura de células e utilizadas para fins experimentais mais de um número limitado de passagens.

Uma vez isolado, miofibroblastos humanas primárias podem ser cultivadas em cultura celular e utilizada ao longo de um número limitado de passagens (até à passagem 4). Estas células são caracterizados como sendo um liso-actina de músculo e vimentina positivo, e desmina negativa (Figura 1A), consistente com os miofibroblastos subepiteliais intestinais 5,7. Eles também têm uma estreladas morfologia característica (Figura 1B). Miofibroblastos primários podem então ser...

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Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

O miofibroblastos é uma célula estromal influente do tracto gastrointestinal, que regula os processos fisiológicos importantes em estados normais e de doença. Descrevemos uma técnica que permite o isolamento de miofibroblastos primários de rato e tanto o tecido do cólon humano, o que pode ser utilizado para experimentação in vitro.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Biologia

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Isolamento de células imunes de tumores primários

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

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Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

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Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

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The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

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Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...