Name: isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00
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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant 5KO8DK085136-02 a JY.

1. Obtener el tejido del colon Ratón Un protocolo para llevar a cabo experimentos con animales, que detalla los fundamentos y objetivos de la investigación, fue presentado y aprobado por nuestra oficina institucional de Investigación Animal de Supervisión. <ol><li> La eutanasia del ratón con isoflurano inhalado seguido por dislocación cervical. </li><li> Haga una incisión en la línea media ventral, retraer el intestino delgado de distancia e identificar el...

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li><li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line.">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li><li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

La técnica general es similar cuando se utiliza el ratón o de colon humano. Esta técnica también se puede utilizar para aislar miofibroblastos en el intestino delgado. Los detalles específicos para el aislamiento de miofibroblastos de 1. ratón y 2. colon humano se discuten a continuación. 1. Ratón Colon Irrigación del colon de ratón se facilita uniendo un 4 en, 16 G Popper aguja de extremo romo a un extremo del colon. Esto también ayuda al cortar el colon...

La regulación de la función del tracto gastrointestinal (GI), implica complejas interacciones dinámicas entre la capa de la mucosa y su mesénquima subyacente. Estas interacciones normalmente sirven para mantener la homeostasis, pero también puede conducir al desarrollo de enfermedades en condiciones patológicas 1. Los miofibroblastos son una subpoblación de células del estroma situado subyacente a la capa epitelial que se comunican de una manera paracrina y la zona subpoblaciones de células para regular una serie de procesos del tracto GI críticos que incluyen la regeneración de la mucosa, la reparación, y la fibrosis 2. La línea celular 18Co es un ejemplo de una línea celular humana de colon miofibroblastos que ha sido ampliamente utilizado para estudiar la función de miofibroblastos ya que comparte muchas de las características de primaria en miofibroblastos in situ. Estos incluyen la expresión de la proteína de un liso-actina de músculo (α-SMA) y vimentina, así como la expresión de un númerode receptores de la superficie celular tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico, o receptores para el ácido 3,4 lisofosfatídico. Debido a estas características ultraestructurales comunes, así como similitudes en la función biológica 5, la línea celular de 18Co se ha utilizado ampliamente para estudiar la función de miofibroblastos en el contexto de muchos estados de enfermedad tales como la enfermedad inflamatoria intestinal o 3,6 cáncer colorrectal. Sin embargo, hay limitaciones inherentes y preocupaciones al utilizar una línea celular. Estos incluyen la inestabilidad genotípica con el tiempo que diferencia líneas celulares a partir de células primarias, alterando el fenotipo y la función biológica de la célula, incluyendo las tasas de crecimiento y las interacciones con otras poblaciones celulares. Las líneas celulares también carecen de los componentes normales de la microambiente GI (epitelial, estromal, y componentes vasculares), que es una limitación importante para su uso. Por lo tanto, las conclusiones extraídas de la investigación experimental línea celular requiere una validación adicional de rsk de una mala interpretación. Miofibroblastos primarias pueden ser obtenidas a partir de tejido de colon humano y el ratón para confirmar los hallazgos experimentales identificados en una línea celular 7. El método fue descrito originalmente por Mahida, et al. 8, y el protocolo es una de las muchas técnicas bien descritos que se pueden utilizar para aislar miofibroblastos primarios de ratón y de colon humano 9. Para cualquier modelo de ratón de la enfermedad colónica, esta técnica se puede utilizar para aislar miofibroblastos primarias para estudiar cómo interactúan con las células vecinas o contribuir a tanto normal o patológica GI procesa 10,11. Esta técnica se puede utilizar para estudiar cómo miofibroblastos contribuyen a la curación de la mucosa, la fibrosis, y el desarrollo de los adenomas y carcinomas colorrectales. Miofibroblastos primarios también se pueden obtener a partir de tejido de colon humano que ha sido resecado en el momento de la operación de (enfermedad inflamatoria del intestino, estenosis, diverticulitis) benigno o maligno Condiciones. Células primarias aisladas de tejido de colon humano y de ratón se pueden cultivar en cultivo celular y se utilizan en un número limitado de pasajes.

Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase I</td>
 <td>Invitrogen/GIBCO</td>
 <td>#17105-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche</td>
 <td>#1 088 858</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>#14-825-16K</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

El miofibroblastos es una célula estromal del tracto gastrointestinal (GI) que ha ido ganando considerable atención por su papel crítico en muchas funciones gastrointestinales. Mientras que varias líneas celulares myofibroblast están disponibles comercialmente para estudiar estas células in vitro, los resultados de investigación desde una línea de células expuestas a condiciones experimentales de cultivo de células tienen limitaciones inherentes debido a la naturaleza excesivamente reduccionista de la obra. El uso de miofibroblastos primaria ofrece una gran ventaja en términos de confirmación de los hallazgos experimentales identificados en una línea celular. Aislamiento de miofibroblastos primarios a partir de un modelo animal permite el estudio de los miofibroblastos en condiciones que imitan más estrechamente se estudió el estado de enfermedad. Aislamiento de miofibroblastos primarios de tejido del colon humano ofrece sin duda los datos experimentales más relevantes, ya que las células vienen directamente de los pacientes con la enfermedad de base. Se describe una técnica bien establecida que puede ser utilized aislar miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano. Estas células aisladas se han caracterizado a ser actina alfa del músculo liso y vimentina-positivo, y negativo-desmina, consistente con los miofibroblastos subepiteliales intestinales. Células miofibroblastos primarias se pueden cultivar en cultivo celular y se utilizan para fines experimentales más de un número limitado de pasajes.

Una vez aislado, miofibroblastos humanas primarias se pueden cultivar en cultivo celular y se utilizan en un número limitado de pasajes (hasta el paso 4). Estas células se caracterizan por ser un suave-actina y vimentina positivo muscular, y desmina-negativo (Figura 1A), en consonancia con los miofibroblastos subepiteliales intestinales 5,7. También tienen una morfología estrellada característica (Figura 1B). Miofibroblastos primarias se pueden utilizar para confirmar lo...

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Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

El miofibroblastos es una célula estromal influyente del tracto gastrointestinal que regula importantes procesos fisiológicos en los estados tanto normales y de enfermedad. Se describe una técnica que permite el aislamiento de miofibroblastos primarios de ratón y tejido de colon humano, que puede ser utilizado para la experimentación in vitro.

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

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Investigación

Biología

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Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells Aislamiento de Primaria cultivos de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

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