Name: isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant 5KO8DK085136-02 till JY.

1. Erhåll Kolon Vävnad Mus Ett protokoll för att utföra djurförsök, med uppgifter om motiv och mål för forskningen, lämnades in och godkänts av vår institutionella Office of Animal Research Oversight. <ol><li> Euthanize musen med inhalerade isofluran följt av halsdislokation. </li><li> Gör en ventrala mittlinjen snitt, dra tunntarmen bort och identifiera kolon. Dra urinblåsan och livmodern (om den finns) i sidled och identifiera blygdbenet och skär ...

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li><li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line.">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li><li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

Den allmänna tekniken är liknande vid användning av antingen mus-eller human kolon. Denna teknik kan också användas för att isolera myofibroblaster från tunntarmen. Specifika detaljer för isolering av myofibroblaster från 1. mus och 2. mänskliga kolon diskuteras nedan. 1. Mouse Colon Bevattning av mus-kolon underlättas genom att fästa en 4 in, 16 G Popper trubbig ände nålen till en ände av tjocktarmen. Detta hjälper också vid skärning kolon på lä...

Regleringen av gastrointestinala (GI) tarmfunktionen innefattar komplexa, dynamiska interaktioner mellan slemhinneskiktet och dess underliggande mesenkym. Dessa interaktioner normalt tjänar till att upprätthålla homeostas, men kan också leda till utveckling av sjukdomstillstånd i patologiska tillstånd 1. Myofibroblaster är en subpopulation av stromaceller belägna underliggande till epitelskiktet att kommunicera på ett parakrint sätt med omgivande cellpopulationer för att reglera ett antal kritiska GI vägarna processer som inkluderar mucosal regeneration, reparation, och fibros 2. Den 18Co cellinje är ett exempel på en människa kolon myofibroblast cellinje som har använts i stor utsträckning för att studera myofibroblast funktion eftersom den delar många av de egenskaper hos primära i situ myofibroblaster. Dessa innefattar det protein expression av a-aktin i glatt muskulatur (α-SMA), och vimentin, såväl som expression av ett antalav cellytreceptorer såsom epidermal tillväxtfaktorreceptor, eller receptorer för lysofosfatidsyra 3,4. På grund av dessa delade ultrastrukturella egenskaper, såväl som likheter i biologiska funktion 5 har 18Co cellinjen använts i stor utsträckning för att studera myofibroblast funktion i samband med många sjukdomstillstånd, såsom inflammatorisk tarmsjukdom eller kolorektal cancer 3,6. Det finns emellertid inneboende begränsningar och problem vid användning av en cellinje. Dessa inkluderar genotypisk instabilitet över tiden som skiljer cellinjer från primära celler, ändra fenotyp och biologiska funktion i cellen, inklusive tillväxt och interaktioner med andra cellpopulationer. Cellinjer som saknar också de normala komponenterna i GI mikromiljö (epitelial, stromal och vaskulära komponenter), vilket är en stor begränsning för dess användning. Därför är slutsatserna från experimentell cellinje forskning kräver ytterligare validering för att minska risk för feltolkningar. Primära myofibroblaster kan erhållas från människa och mus kolonvävnad att bekräfta experimentella upptäckter i en cellinje 7. Förfarandet beskrevs ursprungligen av Mahida et al. Åtta, och våra protokoll är en av många väl beskrivna tekniker som kan användas för att isolera primära myofibroblaster från mus och human kolon 9. För varje musmodell av kolon sjukdom, kan denna teknik användas för att isolera primära myofibroblaster att studera hur de interagerar med angränsande celler eller bidra till både normal eller patologisk GI processer 10,11. Denna teknik kan användas för att studera hur myofibroblaster bidrar till slemhinneläkning, fibros, och utvecklingen av kolorektala adenom och karcinom. Primära myofibroblaster kan även erhållas från human kolonvävnad som har opererande vid tiden för operation för benign (inflammatorisk tarmsjukdom, strikturer, divertikulit) eller elakartad c.ILLKOR. Isolerade primära celler från människa och mus kolonvävnad kan odlas i cellkultur och utnyttjas under ett begränsat antal passager.

Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase I</td>
 <td>Invitrogen/GIBCO</td>
 <td>#17105-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche</td>
 <td>#1 088 858</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>#14-825-16K</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

Den myofibroblast är en stromal cell i gastrointestinala (GI) tarmkanalen som har vunnit stor uppmärksamhet för sin avgörande roll i många GI funktioner. Medan flera myofibroblast cellinjer är kommersiellt tillgängliga för att studera dessa celler in vitro, forskningsresultat från en cellinje utsätts för experimentella cellodlingsförhållanden har inneboende begränsningar på grund av den alltför reduktionistiska arbetets art. Användning av primära myofibroblaster ger en stor fördel när det gäller att bekräfta experimentella upptäckter i en cellinje. Isolering av primära myofibroblaster från en djurmodell möjliggör studiet av myofibroblaster under betingelser som närmare efterliknar sjukdomstillståndet som studeras. Isolering av primära myofibroblaster från human kolonvävnad ger utan tvekan den mest relevanta försöksdata, eftersom cellerna kommer direkt från patienter med den underliggande sjukdomen. Vi beskriver en väletablerad teknik som kan vara utilized att isolera primära myofibroblaster från både mus och human kolonvävnad. Dessa isolerade celler har karakteriserats som alfa-glatt muskulatur aktin och vimentin-positiva, och desmin-negativ, i linje med subepitelial tarm myofibroblaster. Primära myofibroblast celler kan odlas i cellkultur och som används för försöksändamål under ett begränsat antal passager.

När den väl isolerats kan primära humana myofibroblaster odlas i cellkultur och användas över ett begränsat antal passager (upp till passage 4). Dessa celler kännetecknas som en-glattmuskelaktin och vimentin positiv, och desmin-negativa (figur 1 A), i överensstämmelse med tarm subepitelial myofibroblaster 5,7. De har också en karakteristisk stellate morfologi (Figur 1B). Primära myofibroblaster kan sedan användas för att bekräfta experimentella upptäckter i en ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Den myofibroblast är en inflytelserik stromal cell i mag-tarmkanalen som reglerar viktiga fysiologiska processer i både normala och sjukdomstillstånd. Vi beskriver en teknik som möjliggör för isolering av primära myofibroblaster från både mus och human kolonvävnad, som kan användas för in vitro-experiment.

Isolering av primära Myofibroblaster från mus och Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuronal Nuclei Isolering från Human obduktion hjärnvävnad

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolering av immunceller från primära tumörer

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naiv Vuxna stamceller Isolering från primära humana fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

RNA Isolering från mus Pankreas: En Ribonuclease rika Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering och Funktionell analys av mitokondrier från odlade celler och mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering av Myofibroblaster från mus och Human matstrupen

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering och kultur av primära muskeratinocyter från neonatal och vuxen mushud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Isolering och karakterisering av vuxna hjärtfibroblaster och Myofibroblaster

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...