Name: permeabilization of adhered cells using an inert gas jet
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet at JoVE.com

De auteurs willen graag de volgende financieringsbronnen bedanken: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC).

1. Ontwikkeling van LabView Program <ol><li> Een massadebietregelaar (MKS M100B Mass-Flo Controller) is de heliumgas lijn bevestigd aan een nauwkeurige gasstroom te waarborgen. Deze wordt bediend door een ingangsspanning tussen 0 en 5 V. Een regelkring in het LabView programma bepaalt de gewenste spanning op een bepaald moment. Interfacing tussen de computer en de massadebietregelaar wordt uitgevoerd door een data-acquisitie apparaat (NI USB-6009), en een 12 V voeding levert stroom aan de massastroom controller. </li>...

<ol>
	<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+humans--immunotherapy+of+patients+with+advanced+melanoma,+using+tumor-infiltrating+lymphocytes+modified+by+retroviral+gene+transduction.">Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction.</a> The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+immunity+to+viral+antigens+limits+E1-deleted+adenoviruses+for+gene+therapy.">Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection:+a+highly+efficient,+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure.">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).</li><li>Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+method+for+primary+cells.">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).</li><li>Rauth, S., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+DNA+Transferred+into+Mammalian-Cells.">Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells.</a> J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).</li><li>Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+gene+transfer+(electroporation)+into+mouse+Friend+and+human+K562+erythroleukemic+cells.">Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells.</a> Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).</li><li>Fechheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+with+plasmid+DNA+by+scrape+loading+and+sonication+loading.">Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).</li><li>Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+enhancement+of+liposome-mediated+cell+transfection+is+caused+by+cavitation+effects.">Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 26, 897-903 (2000).</li><li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection.">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 24, 587-595 (1998).</li><li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment.">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li><li>Hallow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+intracellular+loading+of+cells+with+molecules+by+controlled+microfluidics.">Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).</li><li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection.">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li><li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications.">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion.">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li><li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration.">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).</li></ol>

Inert gas jet permeabilization is een nuttige techniek voor het aanhangend celtransfectie. Het biedt de mogelijkheid om biomoleculen overdracht in cellen met behulp van mechanische krachten, waardoor de behoefte aan potentieel schadelijke chemicaliën of virale vectoren elimineert. De techniek zou kunnen geven onderzoekers en werkers een efficiënte en relatief eenvoudige wijze nauwkeurig te transfecteren. De selectiviteit van de permeabilisatie is ook uniek voor onderzoekers die slechts bepaalde cellen behandeld met ee...

Met de evolutie van de medische biologie en het begrip van cel mechanica, is de levering van biomoleculen in cellen van vitaal belang voor vele onderzoeksgebieden en medische therapieën. Verschillende technieken zijn ontwikkeld om vreemde moleculen te introduceren door het plasmamembraan en de cel cytosol. Deze kunnen in het algemeen worden geclassificeerd als: virale, chemische of mechanische technieken. Virale technieken genetisch materiaal transfecteren zoals RNA en DNA onder toepassing van virale vectoren 1. Virale technieken hebben de neiging om een hoog rendement behalen in bepaalde cellijnen, maar ze hebben wel het potentieel voor immuun-en ontstekingsreacties 2. Gebruikelijke chemische transfectie werkwijzen omvatten precipitatie met calciumfosfaat 3, bacteriële exotoxinen 4 en 5 lipofectie. Deze technieken hebben bewezen effectief te zijn, maar ook problemen zoals toxiciteit cel en niet specifiek. Bovendien technieken zoals calcium Phosphate precipitatie gevonden transfectie efficiënties tot 70% maar alleen in bepaalde cellijnen, primaire cellen zelden 6. Dit is opmerkelijk het verhogen onderzoeksinspanningen worden in primaire cellen brengen, met name bij het ontwerpen van verschillende behandelingen voor klinisch gebruik en de studie van DNA functioneren. Tijdelijke verstoring van het celmembraan door mechanische stimuli is een alternatief voor het inbrengen van vreemde moleculen in cellen. Technieken omvatten: micro-injectie van moleculen 7, elektroporatie met behulp van een elektrisch veld aan het membraan 8,9 verstoren, sonoporatie met ultrasone golven aan het celmembraan 10-12, met deeltjes verstoren zoals blijkt uit de &quot;gene gun&quot;, welke deeltjes gebonden met scheuten genen in de cel 13, en meer recent, de toepassing van vloeistofschuifspanning die is getoond om tijdelijk doorlaatbaar zoogdiercellen 14,15. Hoewel monteural methoden voorkomen dat sommige van de bovengenoemde onderwerpen, zijn ze meestal gepaard met een lagere efficiëntie en zeer complexe en gespecialiseerde instellingen. Een atmosferische druk glimontlading fakkel (APGD-t) is ontwikkeld aan de McGill met het oorspronkelijke doel van functionaliserende oppervlakken en losmaken hechtende cellen in vitro 16. Vanzelf werd ontdekt dat een levende / dode vlek gebruikt werd ergens in genomen door cellen zonder permeabilisatie middel toegevoegd. Bovendien, dit leek te hebben plaatsgevonden alleen in gebieden van de putten, die toevallig overeenkomen met de fakkel pad beperkt. Onderzoek naar de permeabilisatie mogelijkheden van de APGD-t voortgezet en controle studies bleek dat de drager inert gas straal van het plasma zonder excitatie was ook in staat om cellen te permeabiliseren. Deze tegenspraak met de eerste hypothese dat de reactieve stoffen die door het plasma jet tijdelijk verminderde het membraan functie en suggereerde dat gewoon de mechanischecal krachten waren voldoende om cel permeabilisatie veroorzaken. Vanaf hier studies verder in ons lab om te proberen en te kwantificeren en karakteriseren van de permeabilisatie efficiëntie van een inert gas jet evenals blik op de transfectie mogelijkheden 16. Door deze studies is gebleken dat microporiën daadwerkelijk deel in het plasmamembraan en deze poriën vaak sluit op ongeveer 5 sec 15. We hebben bruikbaarheid van de techniek in vitro en in vivo in het chorioallantoïsmembraan van een kippenembryo aangetoond.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vitality hrGFPII-1</td>
			<td>Agilent Technologies Canada</td>
			<td>240143-57</td>
			<td>Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>Life Technologies Inc.</td>
			<td>D22910</td>
			<td>dextran for permeabilization experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Life Technologies Inc.</td>
			<td>L3224</td>
			<td>for counterstaining of mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>for mounting slides when imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Purity Helium</td>
			<td>Praxair Canada Inc.</td>
			<td>HE 5.0UH-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>for HeLa cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For DMEM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DMEM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. List of required reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Clear TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 22 x 22 Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td>WPI Sizing Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass-Flo Controller</td>
			<td>MKS</td>
			<td>M100B01314CS1BV</td>
			<td>Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-6009 DAQ Device</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>779026-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniSlide Assembly with stepping motor and controller</td>
			<td>Velmex</td>
			<td></td>
			<td>Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8&#176; stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. List of required equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

permeabilization of adhered cells using an inert gas jet

Verschillende celtransfectie technieken bestaan ​​en deze kunnen worden onderverdeeld in drie grote categorieën: virale, chemische en mechanische. Dit protocol beschrijft een mechanische methode om tijdelijk doorlaatbaar hechtende cellen met een inerte gasstroom die de overdracht van gewoonlijk ondoorlaatbare macromoleculen in cellen kan vergemakkelijken. Wij geloven dat deze techniek werkt door het meegeven van schuifkrachten op het plasmamembraan van hechtende cellen, waardoor de tijdelijke vorming van microporiën. Zodra deze poriën worden gecreëerd, de cellen worden vervolgens doorlaatbaar voor genetisch materiaal en andere biomoleculen. De mechanische krachten betrokken hebben, lopen het risico van blijvend beschadigen of losmaken cellen van hun substraat. Er is dus een beperkt aantal inert gas dynamiek waar deze techniek effectief is. Een inert gas jet is efficiënt gebleken bij permeabilizing verschillende hechtende cellijnen waaronder HeLa, HEK293 en menselijke abdominale aorta endotheelcellen. Dit protocol is geschikt voor de permeabilization van hechtende cellen zowel in vitro en, zoals aangetoond in vivo laten zien kan worden gebruikt voor onderzoek en mogelijk toekomstige klinische toepassingen. Het heeft ook het voordeel van permeabilisatie cellen in een ruimtelijk restrictief, waardoor zeer waardevol onderzoeksinstrument zijn.

Permeabilisatie van HeLa cellen met 10 kDa groene fluorescent dextran met een helium gasstraal met een 0,86 mm inwendige capillair diameter getoond in figuur 1. Cellen werden onmiddellijk na permeabilisatie met 2 pl / ml EthD-1-oplossing (live / DEAD Leefbaarheid / Cytotoxicity Kit) om celdood te visualiseren tegengekleurd. Onmiddellijk na tegenkleuring, werden dekglaasjes gemonteerd en afgebeeld. Deze figuur toont de resultaten van het uitvoeren van de helium gasstraal op drie verschillende uitlaatdruk...

Watch this Scientific Journal Video about Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet at JoVE.com

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de tijdelijke permeabilisatie van hechtende cellen met een inert gas jet. Deze techniek bevordert de overdracht van genetisch materiaal en biomoleculen in hechtende zoogdiercellen door het gebruik van mechanische krachten op het plasmamembraan verstoren.

Permeabilisatie van Gekleefd cellen met behulp van een inert gas Jet

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

Fabricatie van Micro-weefsels met behulp van modules van Collageen gel met cellen

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Een experimenteel systeem om Mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Kwalitatieve Karakterisering van de waterfractie van hydrothermale liquefactie van algen gebruiken 2D gaschromatografie met Time-of-flight massaspectrometrie

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Transmissie van meerdere signalen door middel van een optische vezel met behulp van Golffront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Kwantificeren van micro-organismen in lage concentraties, met behulp van digitale holografische microscopie (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Hoge resolutie elementen met behulp van twee modi van Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand en in de buurt van-veld Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Een nieuwe chirurgische techniek als een fundament voor In Vivo gedeeltelijke lever Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening en identificatie van kleine peptiden gericht op fibroblast groei factor Receptor2 met behulp van een Phage display peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...