Name: permeabilization of adhered cells using an inert gas jet
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet at JoVE.com

Författarna vill tacka följande finansieringskällor: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), naturvetenskaplig och teknisk forskning Council (NSERC).

1. Utveckling av LabView Program <ol><li> En massflödesregulator (MKS M100B Mass-Flo Controller) är fäst till heliumgasledningen för att säkerställa en exakt gasflödeshastigheten. Enheten styrs av en inspänning på mellan 0 och 5 V. En reglerkrets i LabView programmet bestämmer den spänning vid varje given tidpunkt. Gränssnitt mellan datorn och massflödesregulator utförs av en datainsamlingsenhet (NI USB-6009), och en 12 V strömförsörjning ger ström till massflödesregulator. </li><li> Två positioner...

<ol>
	<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+humans--immunotherapy+of+patients+with+advanced+melanoma,+using+tumor-infiltrating+lymphocytes+modified+by+retroviral+gene+transduction.">Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction.</a> The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+immunity+to+viral+antigens+limits+E1-deleted+adenoviruses+for+gene+therapy.">Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection:+a+highly+efficient,+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure.">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).</li><li>Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+method+for+primary+cells.">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).</li><li>Rauth, S., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+DNA+Transferred+into+Mammalian-Cells.">Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells.</a> J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).</li><li>Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+gene+transfer+(electroporation)+into+mouse+Friend+and+human+K562+erythroleukemic+cells.">Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells.</a> Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).</li><li>Fechheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+mammalian+cells+with+plasmid+DNA+by+scrape+loading+and+sonication+loading.">Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).</li><li>Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+enhancement+of+liposome-mediated+cell+transfection+is+caused+by+cavitation+effects.">Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 26, 897-903 (2000).</li><li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection.">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine &amp; Biology. 24, 587-595 (1998).</li><li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment.">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li><li>Hallow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+intracellular+loading+of+cells+with+molecules+by+controlled+microfluidics.">Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).</li><li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection.">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li><li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications.">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion.">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li><li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration.">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).</li></ol>

Inert gas jet permeabilization är en användbar teknik för vidhäftande cell transfektion. Det ger möjlighet att överföra biomolekyler i celler med hjälp av mekaniska krafter, vilket eliminerar behovet av potentiellt skadliga kemikalier eller virala vektorer. Tekniken skulle kunna ge forskare och kliniker ett effektivt och relativt enkelt sätt att exakt transfektera celler. Selektivitet permeabilization är också unikt att låta forskare endast behandla vissa celler i en enda koloni som kan vara användbart i fl...

Med utvecklingen av biomedicin och förståelsen av cellmekanik, har leveransen av biomolekyler till celler blir avgörande för många forskningsområden och medicinska behandlingar. Olika tekniker har utvecklats för att införa främmande molekyler genom plasmamembranet och in i cellens cytosol. Dessa kan i allmänhet klassificeras som antingen: virus, kemiska eller mekaniska tekniker. Viral tekniker kan transfektera genetiskt material såsom RNA och DNA med hjälp av virala vektorer 1. Viral tekniker tenderar att ha en hög effektivitet i vissa cellinjer, men de har potential för immunologiska och inflammatoriska reaktioner 2. Vanliga kemiska transfektion metoder är utfällning med kalciumfosfat 3, bakteriella exotoxiner 4 och lipofektion 5. Dessa tekniker har visat sig vara effektiva, men det uppstår vissa problem, såsom celltoxicitet och icke-specificitet. Vidare tekniker såsom kalcium phosphate nederbörd har visat sig ha transfektionseffektiviteter upp till 70%, men endast i vissa cellinjer, sällan i primära celler 6. Detta är anmärknings som ökade forskningsinsatser sätts in i primära celler, särskilt när det gäller att utforma olika behandlingar för klinisk användning och studier av DNA-funktion. Tidsmässig sönderdelning av cellmembranet genom mekanisk stimuli är ett alternativ för att införa främmande molekyler i celler. Tekniker inkluderar: mikroinjektion av molekyler 7, elektroporering med användning av ett elektriskt fält för att störa membranet 8,9, sonoporation använder ultraljudsvågor för att störa cellmembranet 10 till 12, partikelbombardemang, vilket framgår av den &quot;gene gun&quot;, som skjuter partiklar bundna med gener i cellen 13, och mer nyligen, tillämpningen av vätska skjuvspänningen som har visat sig tidsmässigt permeabilisera däggdjursceller 14,15. Även mekanikeral metoder undvika några av de ovannämnda frågorna, de är oftast åtföljs av lägre effektivitet och mycket komplicerade och specialiserade inställningar. Ett lufttryck glimurladdning brännare (APGD-t) utvecklades vid McGill med det ursprungliga målet för functionalizing ytor och lösgöra vidhäftande celler in vitro 16. Serendipitously, upptäcktes det att en levande / död fläck som används på något sätt tas in av celler utan en permeabilisering medel som läggs till. Dessutom verkade det ha skett endast i begränsade områden i brunnarna som hänt för att matcha upp med facklan vägen. Utredning permeabilization kapacitet APGD-t fortsatt och i kontrollstudier, visade det sig att bäraren inert gas stråle av plasma utan excitation kunde också permeabilize celler. Detta motsade den inledande hypotesen att de reaktiva ämnen som skapas av plasmastråle försämras tillfälligt membranfunktion och föreslog att bara de mekaniskatiska styrkor var tillräcklig för att orsaka cell permeabilization. Härifrån, studier fortsatte i vårt labb för att försöka kvantifiera och karakterisera permeabilization effektiviteten av en inert gas jet samt titta på dess transfektion kapacitet 16. Genom dessa studier har det visat sig att mikroporerna i själva verket formen i plasmamembranet, och dessa porer tenderar att återförsluta inom ca 5 sek 15. Vi har visat att tekniken användbarhet in vitro och in vivo i korioallantoismembranet i ett kycklingembryo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vitality hrGFPII-1</td>
			<td>Agilent Technologies Canada</td>
			<td>240143-57</td>
			<td>Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td>
			<td>Life Technologies Inc.</td>
			<td>D22910</td>
			<td>dextran for permeabilization experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Life Technologies Inc.</td>
			<td>L3224</td>
			<td>for counterstaining of mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>for mounting slides when imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra High Purity Helium</td>
			<td>Praxair Canada Inc.</td>
			<td>HE 5.0UH-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>for HeLa cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For DMEM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DMEM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. List of required reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Clear TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 22 x 22 Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td>WPI Sizing Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass-Flo Controller</td>
			<td>MKS</td>
			<td>M100B01314CS1BV</td>
			<td>Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-6009 DAQ Device</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>779026-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniSlide Assembly with stepping motor and controller</td>
			<td>Velmex</td>
			<td></td>
			<td>Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8&#176; stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. List of required equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

permeabilization of adhered cells using an inert gas jet

Olika cell transfektionstekniker finns och dessa kan brytas ner till tre breda kategorier: virus, kemiska och mekaniska. Detta protokoll beskriver en mekanisk metod för att tidsmässigt permeabilisering vidhäftande cellerna med användning av en inert gasstråle som kan underlätta överföringen av normalt icke-permeabla makromolekyler in i celler. Vi tror att den här tekniken fungerar genom att åstadkomma skjuvkrafter på plasmamembranet av vidhäftande celler, vilket resulterar i tillfällig bildning av mikroporer. När dessa porer skapas är cellerna sedan permeabla för genetiskt material och andra biomolekyler. De mekaniska krafter som är involverade inte riskerar att permanent skada eller lossnar cellerna från deras substrat. Det finns därför ett snävt intervall av inerta gasdynamik där tekniken är effektiv. En inert gas jet har visat sig effektiva på permeabilisering olika fastsittande cellinjer inklusive HeLa, HEK293 och mänskliga buken aorta endotelceller. Detta protokoll är lämpligt för den permeabilization av vidhäftande celler både in vitro och, som vi har visat, in vivo, visande den får användas till forskning och eventuellt i framtida kliniska applikationer. Det har också fördelen av permeabilisering celler i ett rumsligt restriktivt, vilket kan visa sig vara ett värdefullt forskningsverktyg.

Permeabilisering av HeLa-celler med 10 kDa grönfluorescerande dextran med användning av en helium gasstråle med en 0,86 mm kapillär inre diameter visas i figur 1. Cellerna counterstained omedelbart efter permeabilisering med 2 pl / ml EthD-1-lösning (LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit) för att visualisera celldöd. Omedelbart efter motfärgning, var täckglas monterade och avbildas. Denna figur visar resultaten av att helium gasstråle vid tre olika utgångstryck jämfört med ett kontrollpr...

Watch this Scientific Journal Video about Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet at JoVE.com

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

Detta protokoll beskriver ett förfarande för temporär permeabilisering av vidhäftande celler med hjälp av en inert gasstråle. Denna teknik underlättar överföringen av genetiskt material och biomolekyler i adherenta däggdjursceller genom användning av mekaniska krafter för att störa plasmamembranet.

Permeabilization vidhäftat celler med en Inert Gas Jet

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Ett protokoll för att upptäcka och rensning gasfas fria radikaler i Mainstream cigarettrök

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Ett experimentellt system för att studera Mechanotransduction i fetal lunga Celler

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Kvalitativ karakterisering av den vattenhaltiga fraktionen från Hydrothermal Förvätskning av Alger Använda 2D gaskromatografi med Time-of-flight-masspektrometri

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Överföring av flera signaler via en optisk fiber Använda Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Kvantifiera mikroorganismer vid låga koncentrationer använder digitala holografisk mikroskopi (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Högupplösta mönstring med två lägen av Electrohydrodynamic Jet: släpp på efterfrågan och nära-fält Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som en grund för In Vivo delvis lever Engineering i råtta

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rening och analys av en monoklonal antikropp från äggstocksceller från kinesisk hamster med hjälp av ett automatiserat Mikrobioreaktor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening och identifiering av små peptider riktade fibroblast tillväxtfaktor Receptor2 använda en phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...