Name: quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni R01 DK091526 (JO), NSF 0.852.416 (DTE), e Chicago diabete Project.

1. Preparare le isole di topo <ol><li> Sezionare topi C57BL / 6 e isolare isolotti da digestione con collagenasi e separazione gradiente di densità Ficoll. (Fare riferimento ad articoli Giove riferimento in 2,3). </li><li> Incubare isolotti in mezzo RPMI-1640 contenente 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e 20 mM HEPES in piastre Petri (37 ° C, 5% CO 2). Post-isolamento, la cultura isolotti per 24 ore prima di utilizzare negli esperimenti. Utilizzare le isole entro 1-2 giorni per garant...

<ol>
	<li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia.">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li><li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Islet+Isolation:+Part+I:+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue.">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).</li><li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Islet+Isolation:+Part+II:+Purification+and+Culture+of+Human+Islets.">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen.">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device.">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).</li><li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets.">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li><li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice:+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period.">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia.">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li><li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes.">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li><li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator.">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li><li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures.">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li><li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly(dimethylsiloxane)+bioreactors+during+cell+culture.">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li><li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium.">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions.">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li><li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates.">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li></ol>

Le molteplici modalità integrate in questa tecnica isolotto ipossia presenti diversi punti notati qui per la risoluzione dei problemi. In primo luogo le isolette isolate continuano a degradare e disintegrarsi nella cultura a causa di enzimi digestivi dalle cellule acinose. La standardizzazione esperimenti per 1-2 giorni dopo l&#39;isolamento delle isole è quindi fondamentale per ottenere risultati coerenti. In secondo luogo, il flusso acquoso è stato fermato durante l&#39;ipossia e ipossia intermittente per prevenire...

Ipossia dinamica è importante in biologia, in particolare per trapianti di isole Ipossia dinamico è un importante fisiologica così come parametro fisiopatologico in molti tessuti biologici. Variazione ossigeno, per esempio, è un segnale di sviluppo potente nell&#39;angiogenesi. Inoltre, i modelli spaziali e temporali in ipossia modulano HIF1-alfa e giocano un ruolo in malattie come il cancro del pancreas. L&#39;ipossia è anche un fattore di confusione che interessano gli esiti del trapianto di isole pancreatiche. Recentemente, temporalmente oscillazioni di ipossia, o ipossia intermittente (IH) hanno dimostrato benefici in &quot;precondizionamento&quot; isolotti 1. Tuttavia, gli effetti di ipossia sia statici e transitori su isolotto fisiologia devono ancora essere ben compreso o studiato, principalmente a causa della mancanza di strumenti adeguati per controllare microambiente di isolotto. Isolotti sono ben vascolarizzata in vivo Isole pancreatiche sono 50-400<html> M aggregati sferoidali di cellule endocrine, comprese cellule beta e alfa-cellule che sono responsabili per l&#39;omeostasi del glucosio; 56. Quando isolotti sono esposti a stimolatorio glucosio nel sangue, l&#39;assorbimento e la glicolisi piombo per la produzione di ATP, che apre potassio ATP-sensibili (K ATP) canali e risultati in ingresso di calcio che innesca l&#39;esocitosi di granuli di insulina. L&#39;ossigeno è importante per guidare questo processo fortemente metabolico e la secrezione di insulina è significativamente influenzato dalla dinamica del flusso di sangue e ossigeno in aggiunta a gradienti di glucosio. Isolotti facilmente eseguire questa risposta di glucosio-insulina in vivo in quanto sono altamente perfusi nel pancreas, ciascuno entro una lunghezza di cella da un vaso capillare. Tuttavia, la fitta rete di capillari intraislet viene rimosso dalla collagenasi durante isolotto di isolamento 2,3. Di conseguenza, sia l&#39;ossigeno e nutrienti forniture sono vincolati ad un perimetro 100 micron a causa di limitazioni di diffusione. successo step &quot;&gt; Le tecniche attuali sono limitate a ricreare isolotto microambiente Ossigeno e glucosio dinamiche nativi Ricreare di isole, la chiave per modellare condizioni fisiologiche e fisiopatologiche, è difficile da raggiungere con le camere ipossiche standard che richiedono il flusso elaborata e privi di monitoraggio continuo delle funzioni insulari. Inoltre, le terapie di trapianto per il diabete di tipo I espongono isole isolate all&#39;ipossia nel sistema portale epatico 4 che ha una più bassa pO 2 (&lt;2%, 5-15 mmHg) rispetto al pancreas fisiologica (5,6%, 40 mmHg). Post-trapianto, gli innesti isole prendono due o più settimane da rivascolarizzati. È stato dimostrato che l&#39;esposizione ipossico altera glucosio-insulina meccanismo di accoppiamento di isolotto. Tra i fattori di accoppiamento stimolo-secrezione, segnalazione di calcio, potenziali mitocondriali, e di insulina cinetica può essere facilmente monitorato mediante microfluidica. Il nostro precedente tecnica di microfluidica dimostrato questo remonitoraggio al-tempo con una precisa modulazione del microambiente acquosa intorno singolo isolotto 5,6. Tuttavia, la quantificazione di danno ipossico di isolotto è ostacolata dalla mancanza di tecniche di stimolazione e il monitoraggio simultaneo. Pertanto, la combinazione di controllo microfluidica di ossigeno e di monitoraggio isolotto in grado di migliorare gli studi di ipossia isolotto. Microfluidics possono ricreare e modulare il microambiente acqueo e ossigeno La tecnica standard per gli studi dei tessuti e la cultura ipossia è stata basata su camere ipossiche. In generale, le camere ipossiche forniscono concentrazioni singole di ossigeno con tempi di equilibrazione a ~ 10-30 min, incompatibili con minuti in scala ipossia dinamico. Due recenti studi utilizzati piccole camere su misura per l&#39;esposizione ipossia intermittente sul complesso topi, con risultati contrastanti sulla glucosio-indotta risposta insulinica 7,8. Tenete a mente che l&#39;intero livello animale, l&#39;ossigeno respirato non è direttamente tranprevisto per isolotto capillare pO 2, a causa di controlli nel sistema respiratorio. Inoltre, questi studi non hanno livelli di ossigeno standardizzati, né forniscono misure in tempo reale a livello tissutale di isolotti. D&#39;altra parte, microfluidica ossigeno possono superare queste limitazioni controllando ossigeno attraverso reti di canali gas. Inoltre, microfluidica è compatibile con imaging dal vivo durante la modulazione di ossigeno, una prodezza momento non è possibile con le camere ipossiche standard. Un certo numero di questi nuovi approcci microfluidica utilizzare la permeabilità ai gas di polidimetilsilossano a dissolversi concentrazioni di ossigeno in microcanali che scorrono media negli cellule bersaglio 9-14. Questi dispositivi hanno integrato anche più discrete concentrazioni di ossigeno, sensori di ossigeno fluorescenza basato, e persino la generazione di ossigeno chimico on-chip. Microfluidica basata solvatazione liquidi hanno difficoltà a mantenere stabili, continue sfumature come it dipende miscelazione convettiva che è sensibile alle condizioni di flusso. In confronto, la tecnica usata qui si concentra sulla riduzione percorso di diffusione di apporto di ossigeno. La solvatazione gas e flusso di taglio sono eliminati diffondendo direttamente ossigeno attraverso una membrana seminati con cellule o tessuti insulari. Questo elimina le microfluidica aggiuntivi necessari per controllare solvatazione e impedisce shear stress inutile per le isole, che a sua volta può innescare il rilascio di insulina. Questa piattaforma è stata utilizzata per dimostrare le specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) up-regulation agli estremi sia iperossici e ipossia (2-97% O 2) in coltura cellulare 1,15. A causa della fornitura diretta di ossigeno e la rimozione di flusso di taglio, la nostra piattaforma basata sulla diffusione fornisce la soluzione ottimale per studiare microfluidica isolotto ipossia. Stimolo e monitoraggio multimodale Microfluidica basata Diffusion-porta anche vantaggi aggiuntivi quando adattato per lo studio mi dell&#39;isolottocrophysiology. Utilizzando una membrana come barriera di diffusione, il liquido può essere isolata dalle modulazioni di ossigeno, permettendo controlli di stimolazioni glucosio acquose indipendentemente da stimoli ipossici. Questo crea una stimolazione simultanea sandwich che spazialmente pin-punti di consegna per le isole. Inoltre, poiché il gas è temporalmente modulata tramite microiniettori computerizzati, possiamo modulare la concentrazione di ossigeno 21-0% digitalmente con il tempo transitorio meno di 60 sec. I controlli dinamici del microambiente ossigeno e glucosio al microscopio permettono un protocollo multimodale in tempo reale che non sarebbe possibile o straordinariamente ingombrante utilizzando camere ipossiche standard. Utilizzando questo dispositivo, segnalazione del calcio (Fura-AM), potenziali mitocondriali (Rodamina 123), e la cinetica dell&#39;insulina (ELISA) sono stati monitorati per fornire un quadro completo della risposta dinamica glucosio-insulina sotto ipossia.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU8-2150/SU8-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate</td>
			<td>PMC Dataplate</td>
			<td>722A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Curing Lamp</td>
			<td>OmniCure</td>
			<td>S1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMDS</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corona Wand</td>
			<td>ETP</td>
			<td>BD-20AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420220000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdispensers</td>
			<td>The Lee Company</td>
			<td>IKTX0322000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 V and 20 V DC Power</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI USB</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>NI USB-6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Omega Engineering, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipulse 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Sensor</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>NeoFox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Finnpipette II 100&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 Fluorescence Dye</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123 Fluorescence Dye</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 in Silicone Tubings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in x 1/8 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in and 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>female Luer plug 1/16 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level

Ossigenazione simultanea e monitoraggio di glucosio stimolo-secrezione di fattori di accoppiamento in una singola tecnica è fondamentale per la modellazione stati patofisiologici di isolotto ipossia, soprattutto in ambienti di trapianto. Tecniche camera ipossiche standard non possono modulare sia stimolazioni Allo stesso tempo, né fornire un monitoraggio in tempo reale dei fattori di accoppiamento stimolo-secrezione di glucosio. Per far fronte a queste difficoltà, abbiamo applicato una tecnica microfluidica multistrato di integrare sia acqueo e modulazioni in fase gas tramite una membrana di diffusione. Questo crea un panino stimolazione attorno agli isolotti microscaled all&#39;interno del polidimetilsilossano trasparente periferica (PDMS), consentono il controllo dei suddetti fattori di accoppiamento tramite microscopia a fluorescenza. Inoltre, l&#39;ingresso del gas è controllato da una coppia di microdispensers, fornendo quantitativi, modulazioni sub-minute di ossigeno tra 0-21%. Questo ipossia intermittente viene applicato a indagare su un nuovo fenomeno di isolat precondizionamento. Inoltre, armati di microscopio multimodale, siamo stati in grado di guardare il calcio dettagliate e dinamiche dei canali K ATP durante questi eventi di ipossia. Noi immaginiamo ipossia microfluidica, in particolare questo simultanea tecnica a due fasi, come un valido strumento per studiare isole così come molti ex vivo tessuti.

Al centro di questa tecnica isolotto ipossia è la capacità di modulare la stimolazione fase acquosa e gassosa nella stessa camera microfluidica con transienti minuto scala. Figura 1 è un risultato rappresentativo della a) doppi stimoli e b) modulazioni veloci misurati all&#39;interno della camera isolotto. Modulazione acquosa, indicato dalla introduzione di fluoresceina nella camera, raggiunge l&#39;equilibrio in tre o quattro minuti dalla miscelazione. Inoltre, l&#39;ossigeno può essere un passo 5-...

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Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Controllo dell&#39;ossigeno microfluidica conferisce più di una semplice comodità e velocità su camere ipossiche per esperimenti biologici. Soprattutto quando attuata tramite diffusione attraverso una membrana, ossigeno microfluidica può fornire liquido simultanea e modulazioni di fase gas a livello di microscala. Questa tecnica permette di esperimenti multi-parametriche dinamiche critica per lo studio isolotto fisiopatologia.

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