Name: quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00
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이 작품은 건강 보조금 R01 DK091526 (JO), NSF 0,852,416 (DTE)의 국립 연구소와 시카고 당뇨병 프로젝트에 의해 지원되었다.

1. 마우스 독도 준비 <ol><li> C57BL / 6 쥐를 해부 및 콜라게나 소화 피콜 밀도 구배 분리에 의해 섬을 격리 할 것. (2,3에서 참조 조브 기사 참조). </li><li> 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 배양 접시에 20 mM의 HEPES를 포함하는 RPMI-1640 배지에 독도를 품다 (37 ° C, 5 % CO 2). 후 분리, 배양 실험에 사용하기 전에 24 시간 동안 섬. 일관된 결과를 보장하기 위해 1-2 일 안에 독도를 사용...

<ol>
	<li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia.">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li><li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Islet+Isolation:+Part+I:+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue.">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).</li><li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Islet+Isolation:+Part+II:+Purification+and+Culture+of+Human+Islets.">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen.">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device.">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).</li><li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets.">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li><li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice:+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period.">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia.">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li><li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes.">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li><li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator.">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li><li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures.">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li><li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly(dimethylsiloxane)+bioreactors+during+cell+culture.">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li><li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium.">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions.">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li><li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates.">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li></ol>

이 섬의 저산소증 기술에 통합 된 여러 양식은 현재 몇 점은 문제를 해결하려면 여기 지적했다. 먼저 고립 된 섬이 저하 인해 선방 세포에서 소화 효소에 문화를 분해하는 것을 계속한다. 섬 격리 후 1-2 일 실험을 표준화하면 일관성있는 결과를 얻기에 따라서 중요합니다. 둘째, 수성 유동은 층류 확산 사이의 경계에서 대류 일소 방지 할 저산소증 및 간헐적 저산소증 동안 중단 하였다. 이것은 베?...

동적 저산소증은 특히 섬 이식, 생물학에서 중요하다 동적 저산소증은 많은 생물 조직에서 중요한 생리뿐만 아니라 병리 생리 학적 매개 변수입니다. 산소의 변화는, 예를 들어, 혈관 신생의 잠재적 발달 신호이다. 또한, 저산소증에 공간과 시간적 패턴 HIF1 - 알파를 조절하고 췌장 암과 같은 질병에 역할을한다. 저산소증은 섬 이식 결과에 영향을 미치는 교란 요인이다. 최근, 저산소증, 또는 간헐적 인 저산소증 (IH)의 시간적 진동은 &quot;사전 조정&quot;독도 1에 혜택을 증명하고있다. 그러나, 섬의 생리에 대한 정적 및 과도 모두 저산소증 효과는 잘 주로 섬의 미세 환경을 제어하는​​ 적절한 도구의 부족으로 이해하고, 공부 못하고있다. 독도 아니라 생체 내에서 혈관이 있습니다 췌장은 50-400입니다<html> 56, 베타 세포와 포도당 항상성에 대한 책임은 알파 세포를 포함한 내분비 세포의 M의 구상 집계. 독도 ATP에 민감한 칼륨 (K ATP) 채널과 인슐린 과립의 세포 외 유출을 유발 칼슘 유입의 결과를 열어 ATP 생산에 혈액, 흡수와 작용 리드 자극 포도당에 노출 된 경우. 산소이 심하게 대사 프로세스를 구동 및 인슐린 분비가 현저 글루코스 구배 이외에 혈류와 산소 공급의 역학에 의해 영향 중요하다. 그들은 높은 각, 췌장 관류대로 독도는 쉽게 모세 혈관에서 하나의 셀 길이 내에서 생체 내에서이 포도당 - 인슐린 반응을 수행 할 수 있습니다. 그러나 intraislet 모세관의 고밀도 네트워크는 아일렛 분리 2,3 동안 콜라게나 제에 의해 제거된다. 따라서, 산소와 영양소를 모두 공급으로 인해 확산 제한으로 100 μm의 경계에 제한됩니다. 섬의 미세 환경을 다시 단계 &quot;&gt; 현재 기술은 제한된 성공 다시 섬의 원시 산소와 포도당 역학, 생리 및 병리 생리 학적 조건을 모델링의 핵심은 정교한 흐름을 필요로하고 섬 기능의 지속적인 모니터링이 부족 표준 저산소 챔버로 달성하기가 어렵습니다. 또한, 유형 이식 치료는 I 당뇨병은 췌장 생리 (5.6 %, 40 mmHg로)에 비해 훨씬 낮은 PO 2 (&lt;2 %, 5 ~ 15 mmHg로) 가지고 간 포털 시스템 4 저산소증에 고립 된 섬을 노출합니다. 이식 후, 섬 이식은 revascularized 될 2 주 이상 걸릴. 이는 저산소 노출 아일릿의 포도당 - 인슐린 결합 메커니즘을 손상하는 것이 증명되었다. 자극 - 분비 커플 링 인자, 칼슘 신호, 미토콘드리아의 잠재력, 인슐린 반응 속도 사이에서 쉽게 미세 유체를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 우리의 이전의 마이크로 유체 기술이 재 입증알 - 시간이 하나의 섬 5,6 주위의 수성 미세 환경의 정확한 조절과 모니터링. 그러나, 섬의 저산소 성 손상의 정량화 동시 자극 및 모니터링 기술의 부족에 의해 좌절된다. 따라서, 산소 및 아일릿 모니터링 미세 유체 제어 결합 아일릿 저산소증 연구를 향상시킬 수있다. 미세 유체는 수성과 산소 미세 환경을 재현하고 변조 할 수있다 조직 문화 저산소증 연구를위한 표준 기술은 저산소 챔버를 기반으로하고있다. 일반적으로, 저산소 챔버 분 스케일 동적 저산소증과 호환 ~ 10 ~ 30 분의 평형 번에 하나의 산소 농도를 제공합니다. 최근 두 연구는 포도당에 의한 인슐린 반응 7,8에 상반되는 결과로, 전체 마우스에 간헐적 저산소 노출 작은 사용자 지정 챔버를 사용했다. 전체 동물 수준에서, 호흡으로 산소가 직접 트란 아니라는 것을 명심인해 호흡기의 컨트롤에, PO 2 모세관 섬 예정. 또한,이 연구는 표준화 된 산소 수준이 없습니다 없으며 독도의 조직 수준에서 실시간 측정을 제공 않습니다. 한편, 산소 가스가 미세 유체 채널 네트워크를 통해 산소를 제어함으로써, 이러한 한계를 넘어 설 수있다. 또한, 미세 유체는 산소 변조시 표준​​ 저산소 챔버와 위업하실 수 없습니다 라이브 영상과 호환됩니다. 이러한 신규 한 마이크로 유체의 숫자는 표적 세포 9-14 위에 미디어 흐름 마이크로 채널에 산소 농도를 용해 된 폴리 디메틸 실록산의 가스 투과성을 이용하는 접근한다. 이 소자는 또한 다수의 이산 산소 농도, 형광 기반 산소 센서 및 온 - 칩에서도 화학적 산소 발생을 통합 하였다. 액체 매화 기반의 미세 유체 내가으로 힘든 시간을 안정적, 지속적으로 그라데이션을 유지하는이T 조건 흐름에 민감하다 대류 혼합에 따라 달라집니다. 비교에서, 우리는 여기에 사용 된 기술은 산소 전달의 확산 경로를 감소에 초점을 맞춘다. 가스 매화 전단 흐름은 직접 세포 나 췌장 조직의 시드 막에 걸쳐 산소를 확산에 의해 제거된다. 이 매화를 제어하는​​ 데 필요한 여분의 마이크로 유체를 제거하고 그 자체가 인슐린 분비를 트리거 할 수있는 섬, 불필요한 전단 응력을 방지 할 수 있습니다. 이 플랫폼은 활성 산소 종 (ROS)을 설명하는 데 사용 된 최대 규제 세포 배양 1.15의과 산소 저산소 두 극단 (2-97%의 O 2)에서. 때문에 산소와 전단 흐름의 제거를 직접 배달에, 우리의 확산 기반 플랫폼은 섬 저산소증 공부를위한 최적의 미세 유체 솔루션을 제공합니다. 모드의 자극 및 모니터링 섬 마일을 공부에 적용 할 때 확산 기반의 미세 유체는 또한 추가 혜택을 제공합니다crophysiology. 확산 장벽 막을 사용함으로써, 액체는 저산소 자극 독립적 수성 글루코스 자극의 컨트롤을 가능하게 산소 변조로부터 단리 할 수​​있다. 이는 독도에 대한 공간적으로 핀 포인트 배달 샌드위치 같은 동시 자극을 만듭니다. 가스가 일시적으로 컴퓨터 microinjectors를 통해 변조 더욱이, 우리는 60 초 미만의 과도와 디지털 21-0% 산소 농도를 조절 할 수 있습니다. 현미경의 산소와 포도당의 미세 환경의 동적 컨트롤은 표준 저산소 챔버를 사용 불가능하거나 매우 성가신되지 않을 것 실시간 멀티 모드 프로토콜을 할 수 있습니다. 이 장치를 사용하여, 칼슘 신호 (의 Fura-AM), 미토콘드리아 전위 (로다 민 (123)), 및 인슐린 속도론 (ELISA)을 저산소 하에서 동적 포도당 인슐린 반응의 완벽한 그림을 제공하기 위해 모니터링되었다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU8-2150/SU8-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate</td>
			<td>PMC Dataplate</td>
			<td>722A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Curing Lamp</td>
			<td>OmniCure</td>
			<td>S1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMDS</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corona Wand</td>
			<td>ETP</td>
			<td>BD-20AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420220000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdispensers</td>
			<td>The Lee Company</td>
			<td>IKTX0322000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 V and 20 V DC Power</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI USB</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>NI USB-6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Omega Engineering, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipulse 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Sensor</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>NeoFox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Finnpipette II 100&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 Fluorescence Dye</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123 Fluorescence Dye</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 in Silicone Tubings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in x 1/8 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in and 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>female Luer plug 1/16 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level

하나의 기술에서 포도당 자극 분비 커플 링 요소를 동시에 산소 및 모니터링은 특히 이식 환경에서, 섬 저산소증의 병리 생리 학적 상태를 모델링하는 것이 중요합니다. 기본 저산소 챔버 기술은 동시에 자극을 변조 또는 이용 글루코스 자극 - 분비 커플 링 요소의 실시간 모니터링을 제공 할 수 없다. 이러한 어려움을 해결하기 위해, 우리는 확산 막을 통해 수성 및 가스 위상 변조 모두를 통합하는 다층 마이크로 유체 기술을 적용 하였다. 이 형광 현미경을 통해 상기 커플 링 요소의 모니터링을 가능하게 투명 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 장치 내의 microscaled 섬 주위에 자극 샌드위치를​​ 만듭니다. 또한, 가스 입력은 0-21% 간의 산소의 정량적, 정 분 변조를 제공 microdispensers의 쌍에 의해 제어된다. 이 간헐적 저산소증이 섬의 새로운 현상을 조사하기 위해 적용T 전처리. 또한, 복합 현미경으로 무장 한, 우리는 이러한 저산소 발생시 상세한 칼슘과 K ATP 채널 역학 볼 수 있었다. 우리는 독도를 공부뿐만 아니라 많은 생체 조직에 가치있는 도구로, 미세 유체 저산소증, 특히이 동시 듀얼 위상 방법을 구상.

이 섬의 저산소증 기술의 중심이 분 규모의 과도와 같은 마이크로 유체 챔버에서 수성과 기상 자극을 조절하는 기능입니다. 그림 1)의 대표 결과 섬의 챔버 내에서 측정 된 듀얼 자극 및 B) 빠른 변조. 챔버에 형광의 도입으로 도시 수성 변조, 혼합 3-4 분 균형을 달성한다. 또한, 산소는 2 분 정도로 짧은 기간에 산소의 순환을 가능하게 빠른 과도로 5-21% 강화 될 수있다. 도 2에</stro...

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Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

미세 유체 산소 제어 생물학적 실험 저산소 챔버를 통해 단지 편리함과 속도보다 더 부여. 막을 통해 확산을 통해 구현 특히, 미세 유체 산소 마이크로 수준에서 동시 액체 및 기체 상 변조를 제공 할 수있다. 이 기술은 섬의 병태 생리를 연구하는 동적 멀티 파라미터 실험은 중요 할 수 있습니다.

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