Name: automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae
Uploaded: 2013-07-04T14:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae at JoVE.com

نشكر شون Pelkowski للمساعدة في تعظيم الاستفادة من مقايسة السلوكية. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، R01 HD060647 والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية، F32 ES021342 وR03 ES017755.

1. جمع الأجنة الزرد ورفع يرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي إدراج أطباق بيركس زجاج مع العشب &quot;وهمية&quot; (المصنوعة من خيوط خضراء) (الشكل 1) إلى الخزانات عند الفجر وغادرت في لمدة ساعتين من أجل جمع الأجنة الزرد. يجب سكب الأطباق الزجاجية التي تحتوي على أجنة أكثر من مصفاة المحمولة وتشطف بالماء منزوع الأيونات. وينبغي بعد ذلك نمت الأجنة في الماء البيض. يحتوي على ماء بيضة 60 ملغ / لتر من المحيط الفوري في الماء منزوع الأيونات و 0.25 ملغ / لتر من زرقة الميثيلين، والذي يستخدم كمانع العفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على فرضية التجربة الفردية والأجنة يمكن أن تعامل على الفور أو خلال مراحل معينة من التنمية باستخدام المواد السامة أو الأدوية. وعادة ما يتم حل المواد السامة والمواد الصيدلانية في DMSO (في X تركيز 1،000) وينبغي مواصلة المخفف مباشرة في المياه المتوسطة البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء العلاج الجنينية واليرقات مع الأدوية أو السمومق، يمكن أن يضم اليرقات والأجنة في أطباق بتري العميق في مناطق ذات كثافة من حوالي 50-60 يرقات لكل 50 مل حتى التحليلات السلوكية في 7 DPF (يجب تغيير البيض المحلول المائي على الأقل مرة كل يومين لتجنب نمو الفطريات / البكتيرية من أجنة ميتة). </li></ol> 2. إعداد قوالب للتحليلات السلوكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت خصيصا القوالب البلاستيكية التي تقيس 11.7 سم × 7.6 سم × 5 مم تم بناؤها مخصصة في المنزل. وهناك حاجة إلى قوالب لإنشاء ممرات باستخدام الاغاروز الذي يسفك في لوحات من البلاستيك جيدا واحدة من الحرارية العلمية. البئر مقياس واحد لوحات 12.4 سم × 8.1 سم × 1.2 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القوالب تحتوي على خمسة مسارات التي يتم الزاوية الجانبين في 60 درجة. الممرات في قوالب هي 3.5 ملم عالية مع وجود قاعدة من 18 مم في الجزء العلوي الذي هو أوسع في حين أن عرض القاع هو 14 مم. هناك مم الفجوة بين 4 مسارات في القالب (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد الممرات صب 50 مل من الاغاروز ذاب (0.8٪ الاغاروز في deionizeالمياه د مع 60 ملغ / لتر المحيط الفوري) في لوحة واحدة بشكل جيد. ثم ينبغي أن توضع في قالب ببطء شديد على رأس الاغاروز سائل للقضاء على أي تشكيل فقاعة، ويمكن إزالتها عندما يبرد الاغاروز (والتي تأخذ حوالي 45 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي بذل الممرات الاغاروز لا وقت سابق من يوم واحد قبل التجربة السلوكية هو المراد تشغيلها (لتجنب الاغاروز تجفيف) ويمكن تخزين الممرات في درجة حرارة الغرفة مع الأغطية على الأطباق لمدة تصل إلى ما يقرب من 36 ساعة. وينبغي أن تستخدم الممرات الاغاروز فقط لتجربة واحدة وينبغي بعد ذلك التخلص منها. </li></ol> 3. التقاط الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما يصل الى 20 يرقات يمكن وضعها في كل حارة من لوحات. وتستخدم عادة 5 يرقات لكل حارة لتسهيل تتبع أدق من سرعة السباحة وإلى تقليل عدد اليرقات التي هناك حاجة في التجربة. يمكن ملء الممرات بالماء البيض مع أو بدون الأدوية أو المواد السامة وهذا يتوقف على التجربة. ومع ذلك، ينبغي أن لا تكون الممرات وilled على طول الطريق حتى يتم وضعها في خزانات التصوير، وهذا سوف منع تجاوز. من أجل التناسق، يجب أن يكون يرقات فترة التأقلم من عشر دقائق بعد يتم وضعها في قوالب الاغاروز وضعه على الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر المحمول. سوف تتحرك بكفاءة اليرقات من طبق بيتري إلى الاغاروز حارة تساعد على الحد من التوتر اليرقات. هذا هو أسهل عندما يتم إيواء اليرقات في خزانات ضحلة أو أطباق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشمل خزانات التصوير كاميرا رقمية كانون المستخدمة في التصوير الوقت الفاصل بين وجهاز كمبيوتر محمول. يجب وضع الكاميرا في الجزء العلوي من مجلس الوزراء وتهدف إلى أن الجزء السفلي من مجلس الوزراء حيث يجب أن توضع بوصة شاشة الكمبيوتر المحمول مع شاشة 15.6 مواجهة (الشكل 3). وينبغي وضع أربع لوحات باليد مباشرة على الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر المحمول. في هذا الوقت يمكن تصدرت الممرات قبالة مع الماء البيض أو المعالجة الكيميائية بحيث يكون مستوى مع الجزء العلوي من ممر (للقضاء على الظلال على حواف Lانيس في الصور). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استخدام عرض تقديمي ل PowerPoint لأنها تشكل حافزا مكره لليرقات. في الكرات الحمراء تتحرك الماضي عرضت لالزرد اليرقات في 6 أو 12 لوحات متعددة جيدا 15،17،18. يبدأ برنامج البور الحالي مع خلفية بيضاء فارغة لمدة 15 دقيقة، تليها 15 دقيقة من شريط أحمر متحرك على النصف العلوي من لوحة (الشكل 4). من أجل القضاء على الحرارة المفرطة لليرقات، فمن الأفضل لشراء جهاز كمبيوتر محمول مع شاشة درجة الحرارة لا ترتفع إلى ما فوق 28 درجة مئوية. لتجنب التبخر من السائل داخل الممرات الاغاروز، وينبغي أن تبقى وقت التصوير القصوى إلى أقل من ساعة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي برمجة الكاميرا الرقمية للتصوير الفوتوغرافي الوقت الفاصل، والتقاط الصور كل 6 ثوانى ليصبح المجموع 300 صورة لكل تجربة. ومع ذلك، فإن تواتر وطول يمكن تعديلها اعتمادا على التجربة والقياس الكمي السلوكية. في الآونة التصوير الموسعة الماضي كانوا يعملون باستخدام فترات أطول بين كل صورة. وCAMERويمكن تعيين في دقة أقل للتصوير في سرعة الفيديو (30 لقطة في الثانية الواحدة). بينما يحد من دقة أقل التسجيلات إلى لوحة multiwell واحد، وتسجيلات الفيديو هي مناسبة للتصوير السريع أحداث السباحة 15. </li></ol> 4. تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب فتح الصور مع يماغيج واستخدامها مع ماكرو التي تم كتابتها خصيصا في المنزل. الماكرو تلقائيا انشقاقات قنوات اللون بحيث اللون الأحمر يمكن إزالتها، وينقص الخلفية، ينطبق عتبة، ويحدد اليرقات من خلال تحليل الجسيمات. الماكرو معظم الحالية لمدة خمس تحليل اليرقات لين هو Zebrafish_macro25k. استخدام المطالبات في الماكرو لتعيين عدد من الصور، واللون لتطرح، عتبة الصورة، الخ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يتم تشغيل كافة الصور من خلال الماكرو يماغيج، سيتم عرض ملف النتائج وسيحتوي X، Y إحداثيات اليرقات الفردية لكل صورة جنبا إلى جنب مع عدد الصورة وعدد لين. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب حفظ ملف النتائج في تنسيق Excel وفرزها على أساس الخلفية فارغة مقابل المتحرك خلفية شريط ثم الرقم جيدا. قالب اكسل وينبغي أن تستخدم لديها المعادلات التي بنيت في أن يحدد وضع اليرقات تلقائيا في الآبار، وبعد المسافة بين اليرقات، وسرعة الحركة، وكمية من الراحة. يتم إنشاء قالب اكسل أحدث 25ib في المختبر Creton، والذي يتوفر عند الطلب. ينبغي بناء الرسوم البيانية التي تبين مجموعات العلاج المختلفة في ورقة اكسل جنبا إلى جنب مع تي اختبارات للمقارنة بين مجموعات العلاج والضوابط. التحليل الإحصائي مزيد يمكن القيام بها باستخدام SPSS. </li></ol>

<ol>
	<li>Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drinks+like+a+fish:+zebra+fish+(Danio+rerio)+as+a+behavior+genetic+model+to+study+alcohol+effects.">Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).</li><li>Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+activity+in+zebrafish+embryos:+A+new+method+to+assess+developmental+neurotoxicity.">Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).</li><li>Norton, W., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+organism+for+behavioural+genetics.">Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics.</a> BMC Neuroscience. 11, 90 (2010).</li><li>Levin, E. D., Cerutti, D., Buccafusco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+15.">Ch. 15.</a> Methods of behavioral analysis in neuroscience. , (2009).</li><li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. , 203-253 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kokel, D., Bryan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+behavior-based+identification+of+neuroactive+small+molecules+in+the+zebrafish.">Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 231-237 (2010).</li><li>Rihel, J., Prober, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Behavioral+Profiling+Links+Drugs+to+Biological+Targets+and+Rest/Wake+Regulation.">Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation.</a> Science. 327, 348-351 (2010).</li><li>Cachat, J., Stewart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+behavioral+and+endocrine+responses+to+novelty+stress+in+adult+zebrafish.">Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish.</a> Nat. Protoc. 5, 1786-1799 (2010).</li><li>Cachat, J., Stewart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Neurophenotyping+of+Adult+Zebrafish+Behavior.">Three-Dimensional Neurophenotyping of Adult Zebrafish Behavior.</a> PLoS ONE. 6, e17597 (2011).</li><li>Sledge, D., Yen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+duration+of+exposure+for+developmental+chlorpyrifos-induced+neurobehavioral+toxicity.">Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity.</a> Neurotoxicol. Teratol. 33, 742-751 (2011).</li><li>Stewart, A., Wu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+anxiety-like+phenotypes+in+adult+zebrafish+behavioral+models.">Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 1421-1431 (2011).</li><li>Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+provide+a+sensitive+model+of+persisting+neurobehavioral+effects+of+developmental+chlorpyrifos+exposure:+comparison+with+nicotine+and+pilocarpine+effects+and+relationship+to+dopamine+deficits.">Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+assay+to+measure+responsiveness+of+zebrafish+to+changes+in+light+intensities.">A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities.</a> J. Vis. Exp. (20), e923 (2008).</li><li>Pelkowski, S., Kapoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+imaging+system+for+automated+analyses+of+avoidance+behavior+in+zebrafish+larvae.">A novel high-throughput imaging system for automated analyses of avoidance behavior in zebrafish larvae.</a> Behav. Brain Res. 223, 135-144 (2011).</li><li>Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+developmental+toxicity+by+automated+analyses+of+behavior+in+zebrafish+larvae.">Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae.</a> Unpublished observations. , (2012).</li><li>Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+edge:+pharmacological+evidence+for+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae.">On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).</li><li>Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+sub-chronic+exposure+to+chlorpyrifos+reduces+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae.">Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Neurotoxicol. Teratol. , (2012).</li><li>Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish.">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).</li><li>Colwill, R., Creton, R., Kalluef, A., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish protocols for neurobehavioral research. 66, (2012).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

بينما نحن باستمرار تحسين مقايسة لدينا السلوكية الرواية، فقد كان دائما مفيدا للكشف عن تجنب والسلوك انجذاب بالتماس في الزرد اليرقات 15. وقد أجريت العديد من التجارب لتحسين نتائج الفحص، مثل اللون من التحفيز المستخدمة، العدد المثالي لليرقات لكل حارة، وطول الفحص السلوكية. سابقا، كنا لوحات متعددة جيدا (مع 6 أو 12 بئرا) 15،17،18. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة قمنا بإنشاء القالب حارة رواية لخلق مساحة أكبر للسباحة اليرقات مما يسمح لنا لجمع عدد أكبر من التدابير السلوكية في فحص واحد 16 (الشكل 5). وتشمل التعديلات الأخرى الاختلافات في باور بوينت عرض (حركة تغيير أو طول مقايسة) وحجم الممرات المستخدمة (لدينا أيضا قوالب للممرات الضيقة أكثر). حاليا، وهذا النظام الآلي عالية الإنتاجية هي فريدة من نوعها في قدرتها على قياس طائفة واسعة من السلوكيات في zebrاليرقات عفيش في نفس الوقت مثل السرعة، وتجنب، والقرب من اليرقات الأخرى، وانجذاب بالتماس في لوحات متعددة الحارات. النتائج يمكن الحصول عليها بسرعة ويمكن تحليل عدد كبير من اليرقات في وقت التصوير. النظام على حد سواء غير مكلفة لبناء وسهلة وسريعة لاقامة. وجود قيود من هذا النظام هو أن الحركات 3-D لا يمكن تقييمها في اليرقات الزرد. النظم الآلية التي تتبع الزرد الكبار لديها القدرة 3-D ويمكن التعرف على مجموعة واسعة من السلوكيات مثل حركة أعلى أو لأسفل داخل عمود الماء 10،19. الحد الآخر هو أن نظام التصوير لدينا حاليا لا الأمثل للتحليلات عالية الإنتاجية في سرعة الفيديو. الفيديو التصوير السرعة هو ممكن عندما وضع الكاميرا إلى دقة أقل 15، ولكن هذا يحد من تحليل لوحة واحدة. في استخدام طريقة &quot;لين&quot; التي أنشئت حديثا، يحتاج عدة أجزاء من الفحص ليتم تنفيذها بطريقة دقيقة. عند وضع اليرقات في تيانه الممرات، فمن الأهمية بمكان للتأكد من أن مستوى السائل ضحلة جدا حتى يتم وضع لوحات على الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر المحمول. إذا الممرات مليئة جدا من السائل، فإن اليرقات الهروب إلى المحيط الخارجي للوحة. وبالإضافة إلى ذلك، عند إدراج القالب في الاغاروز، يجب الحرص على خفض العفن ببطء شديد. إذا تم إدراج القالب بسرعة كبيرة جدا، وسوف تشكل فقاعات في الاغاروز وسوف يتم تحديد من قبل J الماكرو صورة كيرقات إضافية. وينصح أنه إذا الممرات الاغاروز لديهم حتى بضعة فقاعات، فمن الأفضل لجعل جديدة. في المستقبل، نود أن تحسين مقايسة لدينا السلوكية لتحليل السلوكيات المعقدة الأخرى مثل التعلم في اليرقات الزرد ودراسة كيف يمكن أن تتأثر التعلم عن طريق التعرض للسميات والمستحضرات الصيدلانية في التنمية في وقت مبكر. ونحن نعمل حاليا على المقايسات التي قد تكون مفيدة لتحليل سلوك التعلم في النتائج السلوكية التي قد تسهل تحديد أي مناطق الدماغ هيتتأثر بعض المواد السامة أو المواد الصيدلانية خلال التنمية. وقد تم تطوير المقايسات الآلي لقياس السلوكيات في الزرد اليرقات 20 وهذه المقايسات التعلم قد تكون قابلة للتعديل لالفرز الفائق الإنتاجية باستخدام استجابة تجنب قوية في لوحات متعددة الحارات. نقترح أن هذا الاختبار السلوكية يمكن أن تستخدم في الدراسات المستقبلية لاختبار الآثار التنموية لعدد كبير من الأدوية والمواد السامة. ان مثل هذه الدراسات توفر ثروة من المعلومات حول عوامل الخطر المحددة والمساهمة في وضع المبادئ التوجيهية للصحة والسلامة أفضل للنساء الحوامل والأطفال.

الزرد أصبحت نموذجا محببا للعلوم الوراثية التنموية والسلوكية، 1-4. تفقس من chorions من خلال 2-3 أيام آخر الإخصاب (DPF)، وتطوير الأجهزة تعمل بشكل كامل من قبل 4-5 DPF، ويحمل عدد كبير من السلوكيات بنسبة 7 DPF 5،6. هي مناسبة بشكل مثالي ليرقات اسماك الزرد التحليلات عالية الإنتاجية بسبب صغر حجم 7،8. البرنامج متاح تجاريا لتحليل الآلي للسلوك في اليرقات والكبار الزرد 9-14. ومع ذلك، يمكن لهذا البرنامج أن تكون مكلفة ولها خيارات محدودة لقياس السلوكيات المعقدة من اليرقات الزرد في لوحات متعددة جيدا. أنشأنا نظام التصوير عالية الإنتاجية الرواية التي هي غير مكلفة لإعداد ويمكن تحديد عدد من السلوكيات المختلفة في 7 DPF الزرد اليرقات 15،16. النظام يسمح لنا بسرعة وكفاءة لاختبار الانحرافات السلوكية خفية بعد التعرض الجنينية إلى عدد منالمستحضرات الصيدلانية والمواد السامة البيئية 16-18. تم بناء النظام باستخدام خزائن خشبية، والتي منزل كاميرا رقمية في الجزء العلوي من مجلس الوزراء. الكاميرا تواجه الهبوط إلى أسفل لمجلس الوزراء حيث يتم وضع جهاز كمبيوتر محمول مع شاشة مواجهة 15. ويستخدم الوقت الفاصل بين التصوير لالتقاط وضع اليرقات في الممرات. يمكن أن يضم اليرقات في ما يصل إلى أربعة لوحات متعددة جيدا أو متعددة الحارات التي تتمركز على الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر المحمول. نحن نستخدم عرض تقديمي ل PowerPoint لأنها تشكل حافزا مكره التي اليرقات الرد عن طريق تحريك بعيدا (تجنب) والسباحة نحو الحافة (انجذاب بالتماس) 15،17. يتم استيراد الصور في يماغيج التي يستخدم ماكرو الآلي لتقسيم قنوات اللون، طرح الخلفية، وتطبيق الحد الأدنى للتعرف على اليرقات الفردية. يتم سرد إحداثيات لكل يرقة في كل صورة، ويمكن إدراجها في ملف إكسل التي نستخدمها لقياس تجنب وthigmotaالسلوك xis، الأسماك لمسافة الأسماك، والسباحة بسرعة، وكمية من الراحة 16.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>198262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>214325</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>One well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-493</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon </td>
			<td>EOS Rebel T1i</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Cabinets</td>
			<td>WoodCraft Towers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laptops</td>
			<td>Acer Aspire</td>
			<td>Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera Lens</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic diffuser</td>
			<td>Pendaflex </td>
			<td>52345</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PowerPoint 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Excel 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae

قمنا بإنشاء نظام التصوير عالية الإنتاجية رواية لتحليل سلوك اليرقات في الزرد لمدة 7 أيام من العمر في لوحات متعددة الحارات. يقيس هذا النظام السلوكيات العفوية وردا على التحفيز مكره، والذي يظهر أن اليرقات عبر عرض تقديمي ل PowerPoint. يتم تحليل الصور المسجلة مع ماكرو يماغيج، الذي يقسم قنوات اللون تلقائيا، ينقص الخلفية، وينطبق عتبة لتحديد موضع اليرقات الفردية في الممرات. يمكننا بعد ذلك استيراد إحداثيات في ورقة اكسل لقياس سرعة السباحة، وتفضيل حافة أو جانب من الممر، ويستريح السلوك، انجذاب بالتماس، وبعد المسافة بين اليرقات، وسلوك التهرب. التغييرات الطفيفة في السلوك يتم بسهولة الكشف عن استخدام النظام لدينا، مما يجعلها مفيدة للتحليلات سلوكية بعد التعرض للسميات البيئية أو المستحضرات الصيدلانية.

في المقايسات لدينا في وقت سابق، وذلك باستخدام كذاب الكرة مكره التحفيز ويرقات النوع البري غير المعالجة التي يتم الرد على الكرة تتحرك عن طريق السباحة أسفل في البئر (سلوك التهرب) ونحو حواف البئر (السلوك انجذاب بالتماس) 15. أكدنا في وقت لاحق أن سلوك انجذاب بالتماس في هذا الاختبار هو مقياس السلوك ذات الصلة القلق في الزرد اليرقات 17. كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في حركة اليرقات بعيدا عن الكرة وتفضيل حافة بالمقارنة مع خلفية بيضاء فارغة. وقد تأكدت هذه السلوكيات أيضا في فحص جديد لدينا باستخدام شريط أحمر متحرك، بل وأصبحت أكثر قوة 16. وعلاوة على ذلك، يمكننا الآن أخذ عينات عدد أكبر من السلوكيات في فحص واحد بما في ذلك سرعة السباحة، والراحة، وتفضيل نهاية أو جانب من البئر، والمسافة بين الأسماك (الشكل 5). اليرقات السيطرة نمت في الماء البيض تظهر تفضيل زيادة لتكون لأسفل في طبق وعلى حافة الممر علىأي fter يتم تقديمها مع التحفيز مكره (تحريك شريط أحمر). ويتم الحصول على نتائج مماثلة عندما تزرع اليرقات في المياه بيضة تحتوي على 1 ميكروغرام / مل DMSO، مذيبة التي يشيع استخدامها في حل مختلف المستحضرات الصيدلانية والمواد السامة و1،000 الحلول الأسهم X. وتظهر نتائج ممثل في الشكل 5 في اليرقات تعامل مع المياه البيض وDMSO (كما الضوابط) وتركيزات متفاوتة من الفوسفات العضوي للآفات التي توجد عادة في الأطعمة غير العضوية. النتائج المعروضة هي عينة من تجربة واحدة. ومع ذلك، عندما كرر، فإن النتائج تشير إلى أن سرعة السباحة والسلوك انجذاب بالتماس يتم تعديلها من قبل تركيزات منخفضة من مبيدات الآفات العضوية الفوسفاتية، والتي تحاكي مستويات الاستهلاك الغذائي في الإنسان 18. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> الشكل 1. وتستخدم صواني جمع. أطباق بيركس زجاج لجمع البريدmbryos من الدبابات الأسماك البالغة. وقطعت الأغطية من الأطباق بيركس وإدراجها مع شبكات من البلاستيك وكان مخيط غزل الخضراء على الشبكات في البلاستيك. هذا يخلق جوا خصبا للالزرد الكبار عن طريق محاكاة البيئة الطبيعية. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> الشكل 2. قالب من البلاستيك والممرات الاغاروز. A) ويظهر العفن على اليسار. يسكب 0.8٪ الاغاروز في لوحة واحدة جيدا؛ يتم إدراج القالب ببطء ثم إزالة عندما يبرد الاغاروز B) لوحة على اليمين يظهر الممرات التي تم إنشاؤها في الاغاروز من قبل قالب من البلاستيك. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> الشكل (3). وكانت خزائن التصوير. خزائن التصوير سبيسيالY بنيت في مختبرنا وتستخدم لتحليلات سلوكية عالية الإنتاجية. تم إرفاق 15 ميجابيكسل كاميرا رقمية إلى الأعلى لمجلس الوزراء إلى أسفل من أجل جمع الوقت الفاصل بين الصور من اليرقات في لوحات المتعدد رقم وضعت على أعلى الشاشة من جهاز كمبيوتر محمول. بين لوحات والشاشة هناك الناشر البلاستيك الذي يستخدم لمنع أنماط تموج في النسيج في الصور التي تم جمعها. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> الشكل 4. الخلفية فارغة ومكره التحفيز باور بوينت، وهذا هو باور بوينت الحالي الذي يتم استخدامه لاستحضار التغيرات السلوكية في اليرقات الزرد. ويوفر الاختلافات السلوكية بين قوي A) الخلفية فارغة وB) شريط أحمر متحرك. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> الشكل 5. السلوكيات كميا في مقايسة الإنتاجية العالية. مثال من السلوكيات التي يتم كميا من الفحص السلوكية لدينا داخل ورقة Excel التي نستخدمها لX، Y إحداثيات من اليرقات. أشرطة بيضاء تظهر البيانات من اليرقات تتعرض لخلفية فارغة وأشرطة حمراء تظهر البيانات من اليرقات تتعرض لشريط متحرك الأحمر في برنامج البور بوينت. الرسوم البيانية تشير القياسات التي يمكن الحصول عليها من التحليل السلوكي أ) النسبة المئوية ليرقات أسفل في الممر، B) النسبة المئوية لليرقات في نهاية الممر، C) نسبة اليرقات على حافة الممر، D) المسافة بين السمك (مم)، E) السباحة سرعة اليرقات (مم / دقيقة)، F) النسبة المئوية بقية اليرقات. في الرسوم البيانية المعروضة، والبيانات هي من treatmوالأنف والحنجرة من اليرقات مع سيطرة DMSO وعدة تركيزات من مبيد تتراوح ،001-،1 ميكرومتر (المستويات التي توجد عادة في النظام الغذائي للإنسان). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

وضعت مختبرنا والإنتاجية العالية نظام التصوير الآلي رواية يمكن أن يكون مفيدا للكشف عن العديد من السلوكيات المختلفة في اليرقات الزرد لمدة 7 أيام من العمر. ويمكن استخدام النظام للكشف عن التغييرات الطفيفة في السلوك بعد أن يكونوا قد تعرضوا اليرقات إلى المواد السامة البيئية أو المستحضرات الصيدلانية.

الآلي التحليلات السلوكية عالية الإنتاجية في يرقات اسماك الزرد

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

طريقة عامة لتقييم الحضانة لالتوق السكروز في الجرذان

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

FIM التصوير وFIMtrack: اثنان أدوات جديدة تسمح عالية الإنتاجية والتكلفة تحليل تحرك الفعال

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

تحليل مخطط كهربية الشبكية من الاستجابة البصرية في الزرد اليرقات

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

الاجتثاث سكان الخلايا العصبية باستخدام ليزر اثنين-فوتون وتقييمها باستخدام الكالسيوم تصوير وتسجيل السلوكية في اليرقات الزرد

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

التحليل السلوكي والفسيولوجي في نموذج حمار وحشي من الصرع

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

الغمر البديل في الجلوكوز لإنتاج فرط السكر في الدم لفترات طويلة في زيبرافيش

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

نموذج الفئران من عدوى الدماغ EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

انتقال المرحلة البصرية من TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية ليرقات حمار وحشي

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE 

في الجسم الحي تصوير الدماغ بالكامل ليرقات الزرد باستخدام المجهر الفلوري ثلاثي الأبعاد

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...