Name: automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae
Uploaded: 2013-07-04T14:00:00
Duration: 9 min 28 s
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हम व्यवहार परख के अनुकूलन में सहायता के लिए शॉन Pelkowski धन्यवाद. इस काम के बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के राष्ट्रीय संस्थान है, R01 HD060647 और पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान, F32 ES021342 और R03 ES017755 द्वारा समर्थित किया गया था.

1. Zebrafish भ्रूण के संग्रह और लार्वा स्थापना <ol><li> &quot;नकली&quot; घास (हरे रंग के धागे से बने) (चित्रा 1) के साथ ग्लास Pyrex व्यंजन zebrafish भ्रूण इकट्ठा करने के क्रम में भोर में टैंक में डाला और दो ​​घंटे के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए. भ्रूण युक्त कांच के बर्तन एक हाथ में झरनी के ऊपर डाल दिया और विआयनीकृत पानी से rinsed होना चाहिए. भ्रूण तो अंडे पानी में हो जाना चाहिए. अंडा पानी विआयनीकृत पानी और 0.25 मिलीग्राम / एक ढालना अवरोध के रूप में प्रयोग किया जाता है जो methylene नीले, के एल में त्वरित महासागर के 60 मिलीग्राम / एल होता है. </li><li> व्यक्तिगत प्रयोग की परिकल्पना के आधार पर, भ्रूण तुरंत या विषैले पदार्थ या दवाइयों का उपयोग कर विकास के विशिष्ट चरणों के दौरान इलाज किया जा सकता है. विषैले पदार्थ और दवाइयों आमतौर पर DMSO में भंग कर रहे हैं (एक 1000 एक्स एकाग्रता में) और आगे अंडा पानी मध्यम में सीधे पतला होना चाहिए. </li><li> दवाइयों या विषैला साथ भ्रूण और लार्वा उपचार के दौरानएस, लार्वा और भ्रूण 7 DPF (अंडा पानी समाधान हर दूसरे दिन कम से कम जीवाणु / कवक विकास से बचने के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए पर व्यवहार का विश्लेषण करती है जब तक 50 मिलीलीटर प्रति 50-60 के बारे में लार्वा के घनत्व पर गहरी पेट्री डिश में रखे जा सकते हैं मृत भ्रूण से). </li></ol> 2. व्यवहार विश्लेषण के लिए Molds तैयारी <ol><li> विशेष एक्स 7.6 सेमी x 5 मिमी घर में कस्टम का निर्माण किया गया 11.7 सेमी उपाय जो प्लास्टिक molds विकसित की है. सांचों थर्मो वैज्ञानिक से ही अच्छी तरह से प्लास्टिक की प्लेट में डाल दिया है जो agarose का उपयोग कर गलियों को बनाने के लिए आवश्यक हैं. एक अच्छी तरह से प्लेटों उपाय 12.4 सेमी x 8.1 सेमी x 1.2 सेमी. </li><li> सांचों पक्षों 60 डिग्री पर angled हैं जिसमें पांच गलियों में होते हैं. सांचों में गलियों नीचे चौड़ाई 14 मिमी है जबकि व्यापक है जो शीर्ष पर 18 मिमी की एक आधार के साथ उच्च 3.5 मिमी. मोल्ड में गलियों (चित्रा 2) के बीच एक 4 मिमी अंतर है. </li><li> गलियों पिघल agarose की 50 मिलीलीटर (deionize में 0.8% agarose डालना तैयार करने के लिएएक भी अच्छी तरह से थाली में 60 मिलीग्राम / एल त्वरित महासागर) के साथ घ पानी. मोल्ड तो किसी बुलबुला गठन को खत्म करने के लिए तरल agarose के शीर्ष पर बहुत धीरे से रखा जाना चाहिए और (लगभग 45 मिनट लगते हैं) agarose ठंडा है जब हटाया जा सकता है. </li><li> व्यवहार प्रयोग (बाहर सुखाने agarose से बचने के लिए) गलियों लगभग 36 घंटे तक के लिए बर्तन पर ढक्कन के साथ कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है चलाने के लिए है पहले agarose गलियों कोई पहले की तुलना में एक दिन में किया जाना चाहिए. agarose गलियों केवल एक प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए और फिर खारिज किया जाना चाहिए. </li></ol> 3. छवि कैद <ol><li> ऊपर से 20 लार्वा प्लेटों के प्रत्येक लेन में रखा जा सकता है. लेन प्रति आमतौर पर 5 लार्वा तैर गति का सबसे सटीक ट्रैकिंग की सुविधा के लिए और प्रयोग के प्रति की जरूरत है कि लार्वा की संख्या को कम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. गलियों के साथ अंडा पानी के साथ या प्रयोग के आधार पर दवाइयों या विषैले पदार्थ के बिना भरा जा सकता है. हालांकि, गलियों च नहीं होना चाहिएवे इमेजिंग मंत्रिमंडल में रखा जाता है जब तक सभी तरह illed, इस सैलाब को रोकने जाएगा. वे agarose के सांचों में रखा और लैपटॉप स्क्रीन के शीर्ष पर तैनात कर रहे हैं के बाद स्थिरता के लिए, लार्वा दस मिनट का अभ्यास होना अवधि होनी चाहिए. कुशलतापूर्वक पेट्री डिश से agarose लेन लार्वा आगे बढ़ लार्वा तनाव को कम करने में मदद मिलेगी. लार्वा उथले टैंक या पेट्री डिश में रखे जाते हैं जब यह सबसे आसान है. </li><li> इमेजिंग मंत्रिमंडल समय चूक फोटोग्राफी और एक लैपटॉप के लिए इस्तेमाल एक कैनन डिजिटल कैमरा भी शामिल है. कैमरा कैबिनेट के शीर्ष पर रखा और एक 15.6 इंच की स्क्रीन लैपटॉप स्क्रीन (चित्रा 3) का सामना करना पड़ के साथ रखा जाना चाहिए जहां कैबिनेट के नीचे की ओर उद्देश्य से किया जाना चाहिए. चार प्लेटों सीधे लैपटॉप स्क्रीन के शीर्ष पर हाथ से तैनात किया जाना चाहिए. यह (एल के किनारों पर छाया खत्म करने के लिए गली के साथ शीर्ष स्तर इतना है कि इस समय गलियों अंडा पानी या रासायनिक उपचार के साथ बंद topped किया जा सकता हैछवियों में Anes). </li><li> एक प्रस्तुति लार्वा के लिए एक aversive प्रोत्साहन के रूप में प्रयोग किया जाता है. पिछले चलती लाल गेंदों में 6 या 12 बहु अच्छी तरह प्लेटें 15,17,18 में लार्वा zebrafish को दिखाया गया. वर्तमान PowerPoint प्लेट के ऊपर आधा (चित्रा 4) पर एक चलती लाल पट्टी के 15 मिनट के द्वारा पीछा 15 मिनट, के लिए एक खाली सफेद पृष्ठभूमि के साथ शुरू होता है. लार्वा overheating को खत्म करने के लिए, यह 28 से ऊपर नहीं जाती है कि एक स्क्रीन तापमान डिग्री सेल्सियस के साथ एक लैपटॉप खरीद करने के लिए सबसे अच्छा है Agarose गलियों के भीतर तरल के वाष्पीकरण से बचने के लिए अधिक से अधिक इमेजिंग समय एक घंटे के नीचे के लिए रखा जाना चाहिए. </li><li> डिजिटल कैमरा प्रयोग प्रति 300 छवियों की कुल के लिए चित्रों को हर 6 सेकंड लेने, समय चूक फोटोग्राफी के लिए प्रोग्राम किया जाना चाहिए. हालांकि, आवृत्ति और लंबाई प्रयोग और व्यवहार मात्रा का ठहराव के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. पिछले बढ़ाया इमेजिंग समय में प्रत्येक छवि के बीच लंबे समय तक अंतराल का उपयोग कार्यरत थे. camerएक वीडियो गति (30 फ्रेम प्रति सेकंड) पर इमेजिंग के लिए एक कम संकल्प पर सेट किया जा सकता है. कम संकल्प एक भी multiwell थाली के लिए रिकॉर्डिंग की सीमा है, जबकि वीडियो रिकॉर्डिंग इमेजिंग तेजी से तैराकी की घटनाओं में 15 के लिए उपयुक्त हैं. </li></ol> 4. छवि विश्लेषण <ol><li> छवियों ImageJ के साथ खुला और विशेष रूप से घर में लिखा गया था कि एक मैक्रो के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए. मैक्रो स्वचालित रूप से लाल रंग हटाया जा सकता है ताकि रंग चैनलों विभाजन पृष्ठभूमि घटाता है, एक सीमा लागू होता है, और कण विश्लेषण से लार्वा को पहचानती है. पांच लेन लार्वा विश्लेषण के लिए सबसे मौजूदा मैक्रो Zebrafish_macro25k है. छवियों की संख्या, घटाया जा करने के लिए रंग, छवि सीमा, आदि स्थापित करने के लिए मैक्रो में संकेत देता है का उपयोग करें </li><li> छवियों के सभी ImageJ मैक्रो के माध्यम से चलाए जा रहे हैं, के बाद एक परिणाम फ़ाइल प्रदर्शित किया जाएगा और एक्स शामिल होंगे, वाई छवि संख्या और लेन नंबर के साथ एक छवि के लिए व्यक्तिगत लार्वा का समन्वय करता है. </ली&gt; <li> परिणाम फ़ाइल एक एक्सेल प्रारूप में बचाया और फिर खाली पृष्ठभूमि बनाम चलती बार पृष्ठभूमि और अच्छी तरह से संख्या के आधार पर हल किया जाना चाहिए. एक Excel टेम्पलेट स्वचालित रूप से कुओं में लार्वा की नियुक्ति निर्धारित करता है कि में बनाया समीकरणों, लार्वा के बीच की दूरी, आंदोलन की गति, और बाकी की राशि है कि प्रयोग किया जाना चाहिए. सबसे वर्तमान Excel टेम्पलेट 25ib अनुरोध पर उपलब्ध है, जो Creton प्रयोगशाला में बनाया जाता है. विभिन्न उपचार समूहों दिखा रेखांकन उपचार समूहों और नियंत्रण के बीच तुलना के लिए टी परीक्षण के साथ एक्सेल शीट में निर्मित किया जाना चाहिए. इसके अलावा सांख्यिकीय विश्लेषण SPSS का उपयोग किया जा सकता है. </li></ol>

<ol>
	<li>Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drinks+like+a+fish:+zebra+fish+(Danio+rerio)+as+a+behavior+genetic+model+to+study+alcohol+effects.">Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).</li><li>Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+activity+in+zebrafish+embryos:+A+new+method+to+assess+developmental+neurotoxicity.">Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).</li><li>Norton, W., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+organism+for+behavioural+genetics.">Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics.</a> BMC Neuroscience. 11, 90 (2010).</li><li>Levin, E. D., Cerutti, D., Buccafusco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+15.">Ch. 15.</a> Methods of behavioral analysis in neuroscience. , (2009).</li><li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+provide+a+sensitive+model+of+persisting+neurobehavioral+effects+of+developmental+chlorpyrifos+exposure:+comparison+with+nicotine+and+pilocarpine+effects+and+relationship+to+dopamine+deficits.">Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+assay+to+measure+responsiveness+of+zebrafish+to+changes+in+light+intensities.">A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities.</a> J. Vis. Exp. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish.">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).</li><li>Colwill, R., Creton, R., Kalluef, A., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish protocols for neurobehavioral research. 66, (2012).</li></ol>

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

हम लगातार अपने उपन्यास व्यवहार परख में सुधार कर रहे हैं, यह हमेशा परिहार और zebrafish लार्वा 15 में thigmotaxis व्यवहार का पता लगाने के लिए उपयोगी हो गया है. कई परीक्षणों इस तरह इस्तेमाल किया प्रोत्साहन के रंग के रूप में, परख के परिणामों का अनुकूलन करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, लेन प्रति लार्वा, और व्यवहार परख की लंबाई के आदर्श संख्या. इससे पहले, हम बहु अच्छी तरह प्लेटें (6 या 12 कुओं के साथ) 15,17,18 इस्तेमाल किया. हालांकि, हाल ही में हम हमें एक भी परख 16 (चित्रा 5) में व्यवहार उपायों की एक बड़ी संख्या को इकट्ठा करने के लिए अनुमति लार्वा के लिए एक बड़ा स्विमिंग स्थान बनाने के लिए उपन्यास लेन ढालना बनाया है. अन्य संशोधनों को PowerPoint दिखाई के रूपांतरों (परख की बदल आंदोलन या लंबाई) और (हम भी अधिक संकरी गलियों के लिए नए नए साँचे है) का इस्तेमाल किया गलियों का आकार शामिल हैं. वर्तमान में, इस उच्च throughput स्वचालित प्रणाली zebr में व्यवहार की एक बड़ी रेंज के लिए उपाय करने की क्षमता में अद्वितीय हैऐसी गति, परिहार, अन्य लार्वा को निकटता, और बहु ​​लेन प्लेटों में thigmotaxis के रूप में एक ही समय में afish लार्वा. परिणाम जल्दी से प्राप्त किया जा सकता है और लार्वा की एक बड़ी संख्या इमेजिंग के समय में विश्लेषण किया जा सकता है. प्रणाली स्थापित करने के लिए निर्माण करने के लिए सस्ता और त्वरित और आसान दोनों है. इस प्रणाली की एक सीमा 3 डी आंदोलनों zebrafish लार्वा में मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है. वयस्क zebrafish ट्रैक कि स्वचालित प्रणालियों 3 डी की क्षमता है और इस तरह के आंदोलन को ऊपर या नीचे पानी स्तंभ 10,19 भीतर के रूप में व्यवहार का एक व्यापक रेंज की पहचान कर सकते हैं. एक और सीमा हमारे इमेजिंग प्रणाली वर्तमान में वीडियो गति से उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुकूल नहीं है. एक कम संकल्प 15 के लिए कैमरा सेट करने के दौरान वीडियो इमेजिंग गति संभव है, लेकिन यह एक ही थाली के लिए विश्लेषण सीमित. नव निर्मित &quot;गली&quot; विधि का उपयोग में, परख के कई भागों एक सटीक ढंग से क्रियान्वित किया जा करने की जरूरत है. टी में लार्वा रखनेवह गलियों, यह प्लेटें लैपटॉप स्क्रीन के शीर्ष पर तैनात कर रहे हैं जब तक तरल पदार्थ का स्तर बहुत उथला है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. गलियों तरल का भी पूरा कर रहे हैं, लार्वा प्लेट की परिधि में बच जाएगा. इसके अलावा, agarose में ढालना सम्मिलित करते समय, देखभाल बहुत धीरे ढालना कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. ढालना भी जल्दी से डाला जाता है, तो बुलबुले agarose में बनेगी और अतिरिक्त लार्वा के रूप में छवि जम्मू मैक्रो द्वारा की पहचान की जाएगी. यह agarose गलियों भी कुछ बुलबुले है, यह नए लोगों को बनाने के लिए सबसे अच्छा है की सलाह दी है. भविष्य में, हम इस तरह के zebrafish लार्वा में सीखने के रूप में अन्य जटिल व्यवहार का विश्लेषण करने और सीखने के प्रारंभिक विकास में विषैले पदार्थ और दवाइयों के लिए जोखिम से प्रभावित हो सकता है कि कैसे की जांच करने के लिए हमारे व्यवहार परख अनुकूलन करने के लिए करना चाहते हैं. वर्तमान में हम व्यवहार परिणामों मस्तिष्क क्षेत्र हैं जो निर्धारित करने की सुविधा हो सकती है जिसमें सीखने के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हो सकता है कि assays पर काम कर रहे हैंविकास के दौरान कुछ विषैले पदार्थ या दवाइयों से प्रभावित. स्वचालित assays के zebrafish लार्वा 20 और इन assays में व्यवहार सीखने बहु लेन प्लेटों में मजबूत परिहार प्रतिक्रिया का उपयोग करके उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए सुधारने योग्य हो सकता है मापने के लिए विकसित किया गया है. हम इस व्यवहार परख दवाइयों और विषैले पदार्थ की एक बड़ी संख्या के विकास के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रस्ताव. इस तरह के अध्ययन विशिष्ट जोखिम वाले कारकों के बारे में जानकारी का एक धन उपलब्ध कराने और गर्भवती महिलाओं और बच्चों के लिए बेहतर स्वास्थ्य और सुरक्षा के दिशा निर्देशों की स्थापना में योगदान होगा.

Zebrafish आनुवंशिक, विकास और व्यवहार विज्ञान 1-4 के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बनते जा रहे हैं. वे 2-3 दिन बाद निषेचन (DPF) द्वारा उनके chorions से पक्षियों के बच्चे 4-5 DPF द्वारा पूरी तरह से कार्य अंगों का विकास, और 7 DPF 5,6 द्वारा व्यवहार की एक बड़ी संख्या में दिखा रहे हैं. Zebrafish लार्वा आदर्श क्योंकि उनके छोटे आकार 7,8 के उच्च throughput विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. सॉफ्टवेयर लार्वा और वयस्क zebrafish 9-14 में व्यवहार के स्वचालित विश्लेषण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है. हालांकि, इस सॉफ्टवेयर का महंगा होना और बहु ​​अच्छी तरह प्लेटें में zebrafish लार्वा की जटिल व्यवहार को मापने के लिए सीमित विकल्प हैं कर सकते हैं. हम स्थापित करने के लिए और 7 DPF zebrafish लार्वा 15,16 में अलग व्यवहार के एक नंबर यों सकता है सस्ता है कि एक उपन्यास उच्च throughput इमेजिंग सिस्टम बनाया. प्रणाली का एक नंबर करने के लिए भ्रूण प्रदर्शन के बाद हमें जल्दी से और कुशलता से सूक्ष्म व्यवहार असामान्यताएं का परीक्षण करने की अनुमति देता हैफार्मास्यूटिकल्स और पर्यावरण विषैले पदार्थ 16-18. प्रणाली कैबिनेट के शीर्ष पर जो घर एक डिजिटल कैमरा लकड़ी अलमारियाँ, का उपयोग कर बनाया गया था. कैमरा एक लैपटॉप 15 सामना करना पड़ रहा स्क्रीन के साथ रखा गया है, जहां कैबिनेट के नीचे करने के लिए नीचे चेहरे. समय चूक इमेजिंग गलियों में लार्वा की नियुक्ति पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. लार्वा लैपटॉप स्क्रीन के शीर्ष पर तैनात कर रहे हैं जो चार बहु ​​अच्छी तरह से या बहु लेन प्लेटें में रखे जा सकते हैं. हम लार्वा धार (thigmotaxis) 15,17 दिशा में दूर जा रहा है (परिहार) और तैराकी से प्रतिक्रिया करने के लिए जो एक aversive प्रोत्साहन के रूप में एक प्रस्तुति का उपयोग करें. छवियाँ एक स्वचालित मैक्रो, रंग चैनलों विभाजित पृष्ठभूमि घटाना, और व्यक्ति के लार्वा की पहचान करने के लिए एक सीमा लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें ImageJ में आयात किया जाता है. निर्देशांक प्रत्येक छवि में प्रत्येक लार्वा के लिए सूचीबद्ध कर रहे हैं और हम परिहार और thigmota यों के लिए जो प्रयोग एक एक्सेल फ़ाइल में सम्मिलित किया जा सकता हैxis व्यवहार, मछली दूरी के मछली, गति, और बाकी 16 की राशि तैरना.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>198262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>214325</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>One well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-493</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon </td>
			<td>EOS Rebel T1i</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Cabinets</td>
			<td>WoodCraft Towers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laptops</td>
			<td>Acer Aspire</td>
			<td>Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera Lens</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic diffuser</td>
			<td>Pendaflex </td>
			<td>52345</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PowerPoint 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Excel 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae

हम बहु - लेन प्लेटों में 7 दिन पुरानी zebrafish लार्वा में व्यवहार के विश्लेषण के लिए एक उपन्यास उच्च throughput इमेजिंग सिस्टम बनाया है. यह प्रणाली एक प्रस्तुति के माध्यम से लार्वा को दिखाया गया है जो सहज व्यवहार और एक aversive उत्तेजना के जवाब के उपाय. दर्ज की छवियों, स्वचालित रूप से रंग चैनलों विभाजन जो एक ImageJ मैक्रो, साथ विश्लेषण कर रहे हैं पृष्ठभूमि घटाता है, और गलियों में व्यक्तिगत लार्वा नियुक्ति की पहचान करने के लिए एक सीमा लागू होता है. हम तो तैरने की गति, लेन के किनारे या पक्ष के लिए वरीयता, आराम व्यवहार, thigmotaxis, लार्वा के बीच की दूरी, और परिहार व्यवहार यों के लिए एक एक्सेल शीट में निर्देशांक आयात कर सकते हैं. व्यवहार में सूक्ष्म परिवर्तन आसानी पर्यावरण विषैले पदार्थ या दवाइयों से संपर्क के बाद व्यवहार विश्लेषण के लिए यह उपयोगी है, जिससे हमारी प्रणाली का उपयोग कर पता चला रहे हैं.

हमारे पहले assays में जंगली प्रकार लार्वा अच्छी तरह से (परिहार व्यवहार) में नीचे तैराकी से और अच्छी तरह से (thigmotaxis व्यवहार) 15 के किनारों की ओर बढ़ गेंद का जवाब, शेख़ी गेंद aversive उत्तेजना इलाज कर रहे हैं कि का उपयोग कर. हम बाद में इस परख में thigmotaxis व्यवहार zebrafish लार्वा 17 में चिंता से संबंधित व्यवहार का एक उपाय है कि पुष्टि की. खाली सफेद पृष्ठभूमि की तुलना में जब लार्वा आंदोलन में महत्वपूर्ण मतभेद दूर गेंद और बढ़त के लिए प्राथमिकता से कर रहे थे. इन कार्यों में भी आगे बढ़ लाल पट्टी का उपयोग हमारी नई परख में पुष्टि की गई और भी अधिक मजबूत 16 हैं. इसके अलावा, हम अब तैरने गति, आराम, अच्छी तरह से अंत या पक्ष के लिए वरीयता, और मछली के बीच की दूरी (चित्रा 5) सहित एक भी परख में व्यवहार की एक बड़ी संख्या स्वाद ले सकते हैं. अंडा पानी में उगाई नियंत्रण लार्वा एक वृद्धि वरीयता पकवान में और गली के किनारे एक पर नीचे होना दिखानेfter वे एक aversive उत्तेजना (लाल पट्टी चलती) के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं. लार्वा 1 ग्राम / मिलीलीटर DMSO, आमतौर पर 1000 एक्स शेयर समाधान के रूप में विभिन्न दवाइयों और विषैले पदार्थ भंग करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक विलायक युक्त अंडे पानी में बड़े हो रहे हैं जब इसी तरह के परिणाम प्राप्त कर रहे हैं. प्रतिनिधि परिणाम अंडा पानी और DMSO (नियंत्रण) के रूप में है और आमतौर पर गैर जैविक खाद्य पदार्थों में मिला organophosphate कीटनाशक के अलग सांद्रता के साथ इलाज के लार्वा में चित्रा 5 में दिखाया जाता है. यह परिणाम एक प्रयोग से एक नमूना है. हालांकि, कई बार जब परिणाम तैरने की गति और thigmotaxis व्यवहार मानव भोजन की खपत 18 में स्तरों जो नकल organophosphate कीटनाशकों की कम मात्रा, द्वारा बदल दिया है कि संकेत मिलता है. <img alt="चित्रा 1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> चित्रा 1. संग्रह ट्रे. ग्लास Pyrex व्यंजन ई एकत्र करने के लिए उपयोग किया जाता हैवयस्क मछली टैंक से mbryos. Pyrex व्यंजन से lids कटौती और प्लास्टिक ग्रिड और हरे रंग के धागे प्लास्टिक में ग्रिड पर सिलना किया गया था के साथ सम्मिलित थे. इस प्राकृतिक वातावरण नकल उतार द्वारा वयस्क zebrafish प्रजनन के लिए एक वातावरण बनाता है. <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> चित्रा 2. प्लास्टिक मोल्ड और agarose गलियों. ए) ढालना बाईं तरफ दिखाया गया है. 0.8% agarose एक एक अच्छी तरह से थाली में डाल दिया है, मोल्ड धीरे डाला और agarose ठंडा है जब तब हटा दिया जाता है बी) के अधिकार पर थाली प्लास्टिक मोल्ड से agarose में बनाई गई गलियों को दर्शाता है.. <img alt="चित्रा 3" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> चित्रा 3. इमेजिंग मंत्रिमंडलों. इमेजिंग मंत्रिमंडल speciall थेy हमारी प्रयोगशाला में बनाया गया है और उच्च throughput व्यवहार विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया. एक 15 मेगापिक्सेल डिजिटल कैमरा एक लैपटॉप के स्क्रीन के शीर्ष पर रखा multilane प्लेटों में लार्वा का समय व्यतीत हो छवियों को इकट्ठा करने के क्रम में नीचे की ओर का सामना करना पड़ कैबिनेट के शीर्ष से जुड़ा था. प्लेटें और स्क्रीन के बीच एकत्र छवियों में मौआ पैटर्न को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक प्लास्टिक विसारक है. <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> 4 चित्रा. खाली पृष्ठभूमि और PowerPoint aversive उत्तेजना. इस zebrafish लार्वा में व्यवहार में बदलाव पैदा करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि वर्तमान PowerPoint है. यह ए) रिक्त पृष्ठभूमि और बी) चलती लाल पट्टी के बीच मजबूत व्यवहार मतभेद प्रदान करता है. <img alt="चित्रा 5" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> चित्रा 5. उच्च throughput परख में मात्रा व्यवहार. हम एक्स, लार्वा के y निर्देशांक के लिए उपयोग कि एक्सेल शीट के भीतर हमारे व्यवहार परख से मात्रा निर्धारित कर रहे हैं कि व्यवहार का उदाहरण है. सफेद सलाखों के एक रिक्त पृष्ठभूमि से अवगत कराया और लाल सलाखों PowerPoint में लाल चलती बार उजागर करने के लार्वा से डेटा दिखाने के लार्वा से डेटा दिखाने के लिए. रेखांकन) बी, गली के अंत पर लार्वा का प्रतिशत, सी) लेन के किनारे पर लार्वा का प्रतिशत, डी) दूरी के बीच लेन में लार्वा की ए) प्रतिशत नीचे व्यवहार विश्लेषण से प्राप्त किया जा सकता है कि माप का संकेत मछली (मिमी), ई) लार्वा (मिमी / मिनट), एफ) लार्वा का प्रतिशत बाकी की गति तैरो. दिखाया रेखांकन में डेटा उपचार से हैDMSO के नियंत्रण और 0,001 से 0.1 माइक्रोन (आमतौर पर मानव आहार में पाया स्तर) को लेकर एक कीटनाशक के कई सांद्रता के साथ लार्वा के ईएनटी. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> .

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Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

हमारी प्रयोगशाला 7 दिन पुरानी zebrafish लार्वा में कई अलग अलग व्यवहार का पता लगाने के लिए उपयोगी है कि एक उपन्यास उच्च throughput स्वचालित इमेजिंग प्रणाली विकसित की है. प्रणाली लार्वा पर्यावरण विषैले पदार्थ या दवाइयों को उजागर किया गया है के बाद व्यवहार में सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Zebrafish लार्वा में स्वचालित उच्च throughput व्यवहार विश्लेषण

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

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