Name: isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

وأيد هذا العمل عن طريق منح AI064184 وAI76322 من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وغرانت 61789-MA-MUR من مكتب أبحاث الجيش للبحوث MST كان مدعوما أيضا من قبل مؤسسة ولش منحة المعاهد الوطنية للصحة منح F1155 وR01GM103655 إلى JSB

وينبغي إعداد كل الحلول مع الماء عالى النقاء وHPLC الصف الميثانول والكلوروفورم. حلول أعد التي تحتوي على المذيبات العضوية مثل الميثانول، والكلوروفورم، أو البيريدين والأحماض المركزة أو قواعد ينبغي إعداد واستخدامها تحت غطاء الدخان الكيميائية. ويمكن تخزين جميع الحلول في...

في هذا البروتوكول قمنا المفصل عزلة هناك أنواع الدهون من الخلايا كاملة من البكتيريا، ووصف TLC أو الأساليب التحليلية القائمة على MS لتوصيف هذه المواد كيميائيا معزولة. جنبا إلى جنب مطياف الكتلة هو استراتيجية قوية لدي نوفو توصيف الهيكلية من المركبات البيولوجية، ولا ?...

عديد السكاريد الشحمي (LPS) هو جزيء السطح الخارجي رئيسية من الكائنات سالبة الجرام تقريبا كل ويتكون من ثلاثة مجالات الجزيئية: أ-O مستضد السكاريد البعيدة، وهو قليل السكاريد الأساسية، والدهون المرتبطة الغشاء والمجال تترسب على النشرة الخارجي لل الغشاء الخارجي طبقة ثنائية 1،2. الدهون والمجال يتكون من 3 ديوكسي-D-مانو أكتوبر-2-ulosonic (KDO) المخلفات والدهون والأنواع الجزيئية، حيث الدهون ويمكن تعريفها بأنها جزء من كلوروفورم للذوبان من LPS على التحلل خفيفة حمض 1، 2. الدهون القياسية جزيء يمكن تعريفها كيميائيا بمثابة العمود الفقري diglucosamine هذا هو ومكرر فسفرته-acylated سداسي؛ متسقة مع الأنواع الدهنية والتي لوحظت في نموذج كائن كولاي (كولاي) 1،2. تسعة جينات أعرب جوهري، الحفظ في جميع أنحاء البكتيريا سالبة الجرام، هي المسؤولة عن إنتاج الدهون مجال (الشكل 1) 1،2. معظم البكتيريا لديها مجموعة إضافية من الجينات، التي تختلف في درجة الحفظ النشوء والتطور، التي تشارك في مزيد من التعديل الكيميائي للدهون A 3. نزع الفسفات، وإزالة السلاسل أسيل، وإضافة الأنصاف الكيميائية مثل السكريات الأمينية (على سبيل المثال aminoarabinose) و / أو phosphoethanolamine هي الأكثر شيوعا لوحظ الأنشطة (الشكل 1). يتم تنشيط العديد من الإنزيمات المسؤولة عن الدهون والتعديل مباشرة عن طريق إشارات البيئية، مثل الكاتيونات ثنائي التكافؤ، أو ينظم التعبير عنها من قبل اثنين من أنظمة الاستجابة منظم مكون 3. وتتوسط الاعتراف الأنواع الدهون A من قبل المضيف نظام المناعة الفطرية التي تول مثل مستقبلات عامل التمايز 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) شارك في مستقبلات 4. قوات مسعور بين MD2 والدهون وسلاسل أسيل، وكذلك بين TLR4 و &#39;مجموعات الفوسفات 1 و 4 من الدهون وتعزيز علاقة قوية من الشفةمعرف A مع TLR4/MD2 4،5. التعديلات التي تغير حالة أسيلة أو شحنة سالبة من الدهون والدهون تأثير TLR4/MD2 يستند الاعتراف والتحفيز المصب من الاستجابة المناعية الفطرية تفعيل NF كيلوبايت وسطاء الالتهاب مثل TNFα وIL1-β 6،7. التعديلات التي تحجب شحنة سالبة من الدهون وأيضا منع جراثيم الببتيدات المضادة للميكروبات الموجبة من الربط إلى سالبة الجرام سطوح الخلايا 3،8. وافترض كثير من الدهون وتعديلات لزيادة اللياقة البدنية البكتيرية تحت ظروف بيئية معينة، مثل داخل المضيف الإنسان أو في مكانة الايكولوجية. لهذا السبب كثير من الإنزيمات تعديل أهدافا جذابة في تطوير عقلانية من المركبات المضادة للميكروبات. التنوع الكيميائي للهياكل الدهون A، فيما يتعلق الحي و / أو البيئة، والآثار البيولوجية من هذه الهياكل المتنوعة جعل توصيف الهيكلية من الدهون ومسعى هاما في روقال انه يدرس من البكتيريا سالبة الجرام. عزل جزيئات الدهون A من البكتيريا كله ينطوي على استخراج LPS من سطح الخلية البكتيرية، وهي خطوة المائي لتحرير الدهون A، يليه إجراء تنقية النهائي 9-11. الإجراء استخراج LPS في معظم الأحيان واستشهد هو الإجراء استخراج المياه الساخنة الفينول، لأول مرة من قبل ويستفال جن 10. بعد تعرض استخراج LPS كله إلى خفيفة حمض المائي الذي يفصل كيميائيا KDO من الهيدروكسيل-6&#39;من السكر الجلوكوزامين البعيدة من الدهون A (الشكل 1). وجود مطبات عديدة لإجراء المياه الساخنة الفينول بما في ذلك استخدام كاشف المخاطر العالية، يطلب ضرورة للحط من الأحماض المستخرجة التعاون النووي والبروتينات، وعدة أيام لاستكمال البروتوكول 10. وقد مختبرنا تطويرها استخراج وعزل الدهون وكما وضعت أول من Caroff ورايتز وهو 12،13. مقارنة مع الإجراءات المياه الساخنة الفينول، وطريقة المقدمة هنا هي أكثر سرعة وكفاءة ويستوعب مجموعة واسعة من وحدات التخزين الثقافة من 5 مل ليتر متعددة. وعلاوة على ذلك، على عكس الاستخراج المياه الساخنة الفينول، أسلوبنا لا تحديد لأنواع السلس الخام أو من LPS، وتوفير الانتعاش الأمثل من أنواع الدهون A. في بروتوكول لدينا، يتم تنفيذ تحلل المواد الكيميائية من الخلايا البكتيرية كله باستخدام مزيج من الكلوروفورم والميثانول والماء، حيث يمكن مكعبات LPS بواسطة الطرد المركزي. وتستخدم مجموعة من التحلل خفيفة الحمضية والاستخراج بالمذيبات (بلاي-داير) لتحرير الدهون A من السكاريد المرفقة تساهميا. تم تطبيق أسلوب بليغ وداير أولا إلى استخراج أنواع الدهون من مجموعة متنوعة من الأنسجة الحيوانية والنباتية 14 أو تعديلها هنا لفصل السكاريد تحلل من الدهون A. في هذه الخطوة الانفصال النهائي، والكلوروفورم الدهون القابلة للذوبان تقسيم انتقائي في أقل العضوية المرحلة. لمزيد من تنقية الدهون A، عكس المرحلة أوأنيوني عمود التبادل اللوني يمكن استخدام 12. بعد عزلة من نوع الدهون من الخلايا بأكملها، عددا من الأساليب التحليلية يمكن استخدامها لتوصيف التركيب الكيميائي للمواد المعزولة مثل الرنين المغناطيسي، TLC، وتحليل يستند إلى MS-. NMR يسمح للتوضيح الهيكلية غير مدمرة، ويقدم تفاصيل الهيكلية المتعلقة الروابط غليكوزيدية، الاحالة لا لبس فيه من مواقف سلسلة أسيل، وتعيين مواقع المرفقات للA التعديلات الدهون مثل aminoarabinose أو phosphoethanolamine 15-17. لم يتم مناقشتها تحليل NMR من الدهون وضمن بروتوكول لدينا، ولكن تم صفها على نحو كاف في أماكن أخرى 15،16. للتحليل السريع TLC استنادا تستخدم أساليب كثير من الأحيان، لكنه يفشل في تقديم معلومات مباشرة حول التركيبة الكيميائية غرامة. بروتوكولات MS تستند هي الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لتوصيف والهياكل الدهون 18،19. المصفوفة المرتبطة الليزر الامتزاز التأين (MALDIوكثيرا ما يستخدم)-MS لمسح الأنواع في البداية سليمة الدهون A. يتم إنشاء الأيونات المشحونة منفردة من الحليلة أعدت وفقا للإجراءات استخراج لدينا. كما هو مطلوب التحليل البنيوي أكثر غرامة، على أساس أساليب MS / MS تكون أكثر إفصاحا من MALDI-MS. إلى جانب لالتأين electrospray (ESI) الدهون اتهم منفردة أو ضرب A أيونات السلائف هي مزيد مجزأة عن طريق الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) أو الإنحلال الضوئي فوق البنفسجية (UVPD)، لتوليد أيونات المنتج بالمعلومات هيكليا 18،20،21. وكثيرا ما ولدت أيضا المنتجات وفقدان محايدة من الدهون والأيونات السلائف خلال ESI-MS توفير طبقة إضافية من المعلومات الهيكلية. وقد ثبت جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) لتكون وسيلة لا غنى عنها وتنوعا لتوضيح هياكل الدهون A. خلال MS / MS، يتم تنشيط أيونات لانتاج نمط تجزئة التشخيصية التي يمكن استخدامها لتوضيح هيكل أيون السلائف. لافا على نطاق واسعilable طريقة MS / MS هو CID. وتنتج هذه الطريقة الأيونات عبر جزء اصطدام السلائف أيون اختيارها بغاز خامل الهدف، مما أدى إلى ترسب الطاقة الذي يؤدي إلى التفكك. وقد ثبت CID أداة حاسمة في تخصيص الدهون هيكل لمجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية 22-33. على الرغم من أن إدارة البحث الجنائي هو الأكثر تنفيذا عالميا طريقة MS / MS، فإنه يولد مجموعة محدودة من الأيونات المنتج. 193 نانومتر UVPD هو البديل والتكميلي الأسلوب MS / MS. يستخدم هذا الأسلوب الليزر لأشرق الأيونات، وامتصاص الفوتونات النتائج في energization من الأيونات والتفكك اللاحقة. هذه الطاقة أعلى MS / MS تقنية تنتج مجموعة أكثر تنوعا من المنتجات من الأيونات CID وبالتالي يوفر أنماط تجزئة أكثر بالمعلومات. على وجه الخصوص، UVPD يتيح المعلومات حول التغييرات الطفيفة في أنواع الدهون وبناء على الانشقاقات في غليكوزيدية، أمين، أسيل وCC ربط السندات 18،21،34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

عديد السكاريد الشحمي (LPS) هو رئيسي جزيء سطح الخلية من البكتيريا سالبة الجرام، تترسب على النشرة الخارجي من طبقة ثنائية الغشاء الخارجي. ويمكن تقسيم LPS في ثلاثة مجالات: القاصي O-السكاريد، وهو قليل السكاريد الأساسية، والدهون والمجال تتكون من الدهون والأنواع الجزيئية وبقايا حمض ديوكسي 3-D-مانو أكتوبر-2-ulosonic (KDO). الدهون والمجال هو العنصر الوحيد الضروري لبقاء الخلية البكتيرية. التوليف التالية لها، والدهون غير معدلة كيميائيا في استجابة للضغوط البيئية مثل درجة الحموضة أو درجة الحرارة، لتعزيز المقاومة لمركبات المضادات الحيوية، والتهرب من الاعتراف من قبل وسطاء من الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة. بروتوكول التالية تفاصيل العزلة الصغيرة والكبيرة الحجم والدهون A من البكتيريا سالبة الجرام. ثم وتتميز المواد معزولة كيميائيا بواسطة طبقة رقيقة اللوني (TLC) أو مطياف الكتلة (MS). بالإضافة إلى مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت لوضوء (MALDI-TOF) MS، ونحن أيضا تصف جنبا إلى جنب MS بروتوكولات لتحليل الدهون والأنواع الجزيئية باستخدام التأين electrospray (ESI) بالإضافة إلى الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) والإنحلال الضوئي فوق البنفسجية المستخدمة حديثا (UVPD) الأساليب. بروتوكولات MS دينا تسمح لتحديد لا لبس فيه من التركيب الكيميائي، أهمية قصوى لتوصيف جزيئات الدهون والتي تحتوي على التعديلات الكيميائية الفريدة أو الرواية. نحن أيضا وصف تسمية بالنظائر المشعة، والعزلة لاحقة، من الدهون (أ) من الخلايا البكتيرية لتحليلها من قبل TLC. نسبة إلى بروتوكولات يستند إلى MS-، TLC يوفر طريقة توصيف أكثر اقتصادا وسريع، ولكن لا يمكن أن تستخدم لتعيين بشكل لا لبس فيه الدهون والبنى الكيميائية دون استخدام معايير التركيبة الكيميائية المعروفة. على مدى العقدين الماضيين أدى عزل وتوصيف الدهون A إلى العديد من الاكتشافات المثيرة التي تحسنت فهمنا للعلم وظائف الأعضاء من البكتيريا سالبة الجرام، آليات المقاومات للمضادات الحيويةوقد وفرت اتجهت الاستجابة المناعية الفطرية الإنسان، والعديد من أهداف جديدة في تطوير مركبات مضادة للجراثيم.

الكنسي الدهون ألف من E. كولاي والسالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية هو ديساكهارايد-acylated سداسي الجلوكوزامين مع مجموعات الفوسفات في 1 - 4 و&#39;المواقف. خلال النمو في وسائل الإعلام الغنية (مثل لوريا مرق) جزء من الدهون ويحتوي على مجموعة بيروفوسفات في موق...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

عزل وتوصيف الدهون ومجال عديد السكاريد الشحمي (LPS) من البكتيريا سالبة الجرام يوفر نظرة ثاقبة الآليات القائمة على سطح الخلية المقاومة للمضادات الحيوية، وبقاء البكتيرية واللياقة البدنية، وكيف كيميائيا الدهون المتنوعة والأنواع الجزيئية تعدل تفاضلي المضيف الاستجابات المناعية الفطرية.

عزل وتوصيف المواد الكيميائية من الدهن من البكتيريا سالبة الجرام

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

الجذور الحرة في علم الأحياء الكيميائي: من السلوك الكيميائي للتنمية العلامات البيولوجية

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

للطي وتوصيف روبوت الحيوية استجابة من الحمض النووي اوريغامي

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

نوكليوزيد Triphosphates - من توليف لتوصيف الكيمياء الحيوية

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

منهج تحليل معكوس لتوصيف النقل الكيميائية في مواد الطلاء

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

أطر توليف وتوصيف بين functionalized المعدنية العضوية

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

توليف وتوصيف المواد الغروية Supramolecular

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

إعداد وتقييم<sup&gt; 99m</sup&gt; ح المسمى ثلاثي الشعب يخلب لما قبل استهداف عن طريق Bioorthogonal الكيمياء

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

الغزل الجاف موائع جزيئية وتوصيف الألياف المجددة Fibroin الحرير

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

إنزيم TET2 انقسام هندسيا للحمض النووي الكيميائية إيندوسيبلي هيدروكسيميثيليشن ويعيد البناء جينية

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...