Name: isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud AI064184 og AI76322 fra National Institutes of Health (NIH) og Grant 61789-MA-MUR fra hæren Research Office til MST Research blev også støttet af Welch Foundation Grant F1155 og NIH tilskud R01GM103655 til JSB

Alle løsninger skal være forberedt med ultrarent vand og HPLC-kvalitet methanol og chloroform. Fremstillede opløsninger, der indeholder organiske opløsningsmidler, såsom methanol, chloroform eller pyridin og koncentrerede syrer eller baser skal fremstilles og anvendes under et stinkskab. Alle opløsninger kan opbevares ved stuetemperatur. Skal måles Opløsningsmidler i en gradueret glascylinder og opbevaret i glasflasker opløsningsmiddel med PTFE foret hætter. Til langtidsopbevaring chloroform-holdige opløsning...

I denne protokol har vi beskrevet isolering af lipid A arter fra hele celler af bakterier, og beskrevet TLC eller MS baserede analysemetoder til kemisk karakterisere denne isolerede materiale. Tandem massespektrometri er en stærk strategi for de novo strukturel karakterisering af biologiske forbindelser, og er uvurderlig for den kemiske karakterisering af opbud af lipid A molekyler observeret i naturen. CID og UVPD er to komplementære aktiverings metoder, der skaber forskellige typer af produkt ioner, der giv...

Lipopolysaccharid (LPS) er den største ydre overflade molekyle næsten alle gramnegative organismer og består af tre molekylære domæner: en distal O-antigen-polysaccharid, en kerne oligosaccharid, og membran-associeret lipid Et domæne aflejret på den ydre blad af ydre membran-dobbeltlag 1,2. Lipid Et domæne består af 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) restkoncentrationer og en lipid A molekylære arter, hvor lipid A kan defineres som den chloroform opløselige del af LPS på mild sur hydrolyse 1, 2. Standarden lipid A molekyle kan kemisk defineret som en diglucosamine rygrad, der er hexa-acyleret og bis-phosphoryleret, i overensstemmelse med de store lipid A-arter observeret i modelorganismen Escherichia coli (E. coli) 1,2. Ni konstitutivt udtrykte gener, konserverede hele gram-negative bakterier, der er ansvarlige for produktion af lipid A-domæne (figur 1) 1,2. De fleste bakterier har et ekstra sæt af gener, som varierer i graden af fylogenetiske bevarelse, der deltager i yderligere kemisk modifikation af lipid A 3. Dephosphorylering, fjernelse af acylkæder, og tilsætning af kemiske dele, såsom aminosukkere (f.eks aminoarabinose) og / eller phosphoethanolamin er de mest almindeligt observerede aktiviteter (figur 1). Mange af de enzymer, der er ansvarlige for lipid En ændring påvirkes direkte af miljømæssige signaler, såsom divalente kationer, eller deres ekspression reguleres af to komponent respons-regulator systemer 3. Anerkendelse af lipid A arter af værten medfødte immunsystem er medieret af Toll-lignende receptor 4/myeloid differentiering faktor 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Hydrofobe kræfter mellem MD2 og lipid A acylkæder samt mellem TLR4 og 1 og 4 &#39;phosphatgrupper af lipid A fremmer den stærke associering læbeid A med TLR4/MD2 4,5. Ændringer, der ændrer acylering stat eller den negative ladning af lipid A indvirkning TLR4/MD2 baserede lipid A anerkendelse og nedstrøms stimulering af medfødt immunrespons aktivatorer NF-KB og mediatorer af inflammation, såsom TNFa og IL1-β 6,7. Modifikationer, der maskerer den negative ladning af lipid A også forhindre baktericide kationiske antimikrobielle peptider binde til gramnegativ celleoverflader 3,8. Mange lipid A modifikationer hypotese at øge bakteriel kondition under specifikke miljøforhold, såsom inde i den menneskelige vært eller i en økologisk niche. Af denne grund mange modifikationsenzymer er attraktive mål i en rationel udvikling af antimikrobielle forbindelser. Kemiske diversitet af lipid A-strukturer med hensyn til organisme og / eller miljø, og de biologiske konsekvenser af disse forskellige strukturer gør den strukturelle karakterisering af lipid A en vigtig bestræbelse i than studere af gram-negative bakterier. Isolering af lipid A molekyler fra hele bakterier involverer ekstraktion af LPS fra den bakterielle celleoverfladen, hydrolytisk trin til at frigøre lipid A, efterfulgt af en endelig rensning procedure 9-11. Det hyppigst citerede LPS udvinding procedure er hot-phenol vand ekstraktion procedure, først introduceret af Westphal og Jann 10.. Efter ekstraktion hele LPS underkastes mild syrehydrolyse, som kemisk adskiller Kdo fra 6&#39;-hydroxylgruppen af den distale glucosamin sukker lipid A (figur 1). Mange faldgruber findes for det varme-phenol vand procedure, herunder anvendelse af en høj risiko reagens, er behovet for at nedbryde medekstraheres nukleinsyrer og proteiner, og flere dage kræves for at fuldføre protokol 10. Vores lab har videreudviklet udvinding og isolering af lipid A som først udviklet af Caroff og Raetz 12,13. Sammenlignet med hot-phenol vand procedurer, metoden præsenteres her er mere hurtig og effektiv og kan rumme en bred vifte af kultur mængder fra 5 ml til flere liter. I modsætning til hot-phenol vand ekstraktioner, vores metode ikke udvælger til ru-eller glat-typer LPS, giver optimal genvinding af lipid A-arter. I vores protokol, er kemisk lysis af hele bakterieceller udført under anvendelse af en blanding af chloroform, methanol og vand, hvor LPS kan pelleteret ved centrifugering. En kombination af mild syrehydrolyse og opløsningsmiddelekstraktionerne (Bligh-Dyer) anvendes til at frigøre lipid A fra covalent bundet polysaccharid. Fremgangsmåden ifølge Bligh og Dyer blev først anvendt til udvinding af lipid arter fra en række dyre-og plantevæv 14, modificeret her at adskille hydrolyserede polysaccharid fra lipid A. I dette sidste separationstrin, chloroform opløselige lipider selektivt opdele i lavere organisk fase. For yderligere at oprense lipid A, omvendt fase elleranionbyttermateriale søjlechromatografi kan anvendes 12. Efter isolering af lipid A-arter fra hele celler, kan en række analytiske metoder anvendes til at karakterisere den kemiske struktur af det isolerede materiale, såsom NMR, TLC og MS-analyse. NMR giver mulighed for ikke-destruktiv strukturel udredning og tilvejebringer strukturel detalje relateret til glycosidbindinger, utvetydig tildeling af acylkæde positioner, og tildeling af bindingssteder for lipid A modifikationer som aminoarabinose eller phosphoethanolamin 15-17. NMR-analyse af lipid A er ikke drøftet i vores protokol, men er blevet beskrevet tilstrækkeligt andetsteds 15,16. For hurtig analyse TLC baserede metoder bruges ofte, men undlader at give direkte oplysninger om fine kemiske struktur. MS baserede protokoller er den hyppigst anvendte metode til at karakterisere lipid A-strukturer 18,19. Matrix forbundet laser desorption ionisering (MALDI)-MS er ofte bruges i første omgang kortlægge intakte lipid A-arter. Enkeltvis ladede ioner er genereret ud fra analyt fremstilles ifølge vores ekstraktionsprocedurer. Som der kræves mere fint strukturel analyse, MS / MS baserede metoder bevise mere informativ end MALDI-MS. Koblet til elektrosprayionisering (ESI) enkeltvis eller formere ladet lipid en forløber ioner er yderligere fragmenteret ved kollision induceret dissociation (CID) eller ultraviolet photodissociation (UVPD), til at generere strukturelt informative produkt ioner 18,20,21. Neutrale tab produkter fra lipid A precursor ioner er også ofte genereres under ESI-MS giver en ekstra lag af strukturel information. Tandem massespektrometri (MS / MS) har vist sig at være et uundværligt og alsidig metode til belysning af lipid A strukturer. I MS / MS, er ioner aktiveres til opnåelse af et diagnostisk fragmentering mønster, som kan anvendes til at belyse strukturen af ​​prækursor-ion. Den mest udbredte available MS / MS metode er CID. Denne metode frembringer fragmentionerne via kollisioner af den valgte prækursor-ion med en inert målgas, hvilket resulterer i energi aflejring, der fører til dissociation. CID har vist sig et kritisk værktøj i tildelingen af lipid A struktur for en lang række bakteriearter 22-33. Selvom CID er den mest universelt implementeret MS / MS metode, det genererer en begrænset vifte af produkt-ioner. 193 nm UVPD er en alternativ og supplerende MS / MS metode. Denne metode bruger en laser til at bestråle ioner, og absorptionen af ​​fotoner resulterer i aktiveringen af ​​ioner og efterfølgende dissociation. Denne højere energi MS / MS-teknik giver en mere mangfoldig vifte af produkt-ioner end CID og dermed giver mere informative fragmenteringsmønstre. Især UVPD giver information om subtile ændringer i lipid A-arter er baseret på skel på glycosidbindingen, amin, acyl-og CC-obligationer 18,21,34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

Lipopolysaccharid (LPS) er den vigtigste celleoverflademolekylet af gram-negative bakterier, anbragt på den ydre blad af ydre membran-dobbeltlaget. LPS kan opdeles i tre områder: den distale O-polysaccharid, en kerne oligosaccharid og lipid Et domæne bestående af et lipid A molekylære arter og 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic syrerester (KDO). Lipid A domæne er den eneste komponent af afgørende betydning for bakteriecelle overlevelse. Efter sin syntese, er lipid A kemisk modificeret som reaktion på miljømæssige påvirkninger såsom pH eller temperatur, for at fremme resistens over for antibiotika forbindelser, og for at undgå anerkendelse af mediatorer af svar værtens medfødte immunforsvar. Følgende protokol beskriver de små-og store isolation af lipid A fra gram-negative bakterier. Isolerede materiale derefter kemisk karakteriseret ved tyndtlagskromatografi (TLC) eller massespektrometri (MS). Ud over at matrix-assisteret laser desorption / ionisering tid for flys (MALDI-TOF) MS, vi også beskrive tandem MS-protokoller til at analysere lipid A molekylære arter ved hjælp af elektrospray (ESI) koblet til kollision induceret dissociation (CID) og nyansatte ultraviolet photodissociation (UVPD) metoder. Vores MS protokoller gør det muligt for entydig bestemmelse af kemisk struktur, altafgørende for karakterisering af lipid A molekyler, der indeholder unikke eller nye kemiske modifikationer. Vi beskriver også den radioisotopisk mærkning og efterfølgende isolation af lipid A fra bakterieceller til analyse ved TLC. I forhold til MS-baserede protokoller, TLC giver en mere økonomisk og hurtig karakterisering metode, men kan ikke anvendes til utvetydigt at tildele lipid A kemiske strukturer uden anvendelse af standarder med kendt kemisk struktur. I løbet af de sidste to årtier isolering og karakterisering af lipid A har ført til mange spændende opdagelser, der har forbedret vores forståelse af fysiologi af gram-negative bakterier, mekanismer af antibiotika resistensafstanden, respons menneskets medfødte immunforsvar, og har givet mange nye mål i udviklingen af ​​antibakterielle forbindelser.

Canonical lipid A fra E. coli og Salmonella enterica serovar typhimurium er en hexa-acyleret disaccharid af glucosamin med fosfatgrupper på 1 - og 4 &#39;-positioner. Under vækst i rigt medie (fx Luria Broth) en del af lipid A indeholder en pyrophosphat-gruppe i 1-stillingen til opnåelse af en Tris-phosphorylerede arter 36 (fig. 1). Kdo (3-deoxy-D-manno-octulosonsyre), er fastgjort ved 6&#39;-hydroxylgruppen og fungerer som en bro til at forbind...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolering og karakterisering af lipid A-domænet af lipopolysaccharid (LPS) fra gram-negative bakterier giver indsigt i celleoverflade mekanismer antibiotikaresistens, bakteriel overlevelse og fitness, og hvor kemisk forskellige lipid A molekylspecies differentielt modulere værtens medfødte immunresponser.

Isolering og kemisk karakterisering af lipid A fra gramnegative bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Frie radikaler i Chemical Biology: fra Chemical adfærd til Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Foldning og karakterisering af en Bio-responsiv Robot fra DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nucleosidtriphosphater - Fra Syntese til Biokemisk karakterisering

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

En omvendt analyse tilgang til karakterisering af kemiske Transport i Maling

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntese og karakterisering af funktionaliserede Metal-organisk Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forberedelse vedhæftende celler for X-ray fluorescens Imaging af Chemical Fiksering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering af supramolekylære Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Udarbejdelse og evaluering af<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-mærket tridentat Chelater for Pre-targeting Brug Bioorthogonal Kemi

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Mikrofluid tør-spinning og karakterisering af folier silke Fibroin fibre

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

En manipuleret Split-TET2 enzym til kemikalie-inducerbar DNA Hydroxymethylation og epigenetiske Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...