Name: isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים וAI064184 AI76322 מן המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ועל ידי גרנט 61,789-MA-MUR ממשרד המחקר של הצבא למחקר MST גם נתמכה על ידי הקרן וולש גרנט F1155 ומענק NIH R01GM103655 לJSB

צריכים להיות מוכנים כל הפתרונות עם מים ultrapure ומתנול HPLC כיתה וכלורופורם. פתרונות מוכנים המכילים חומרים ממסים אורגניים כגון מתנול, כלורופורם, או פירידין וחומצות או בסיסים מרוכזים צריכים להיות מוכנים ומשמשים תחת מנדף הכימי. ניתן לאחסן את כל הפתרונות ב RT. ממסים צריכים לה...

בפרוטוקול זה יש לנו מפורט הבידוד של מיני שומנים מהתאים של חיידקים כולה, ותיארו את TLC או שיטות אנליטיות המבוססות MS לאפיין חומר מבודד זה מבחינה כימית. ספקטרומטריית מסת טנדם היא אסטרטגיה רבת עוצמה לאפיון מבני דה נובו של תרכובות ביולוגיות, ולא יסולא בפז לאפיון הכימי ...

Lipopolysaccharide (LPS) הוא מולקולת המשטח החיצונית העיקרית של כמעט כל יצורי גרם שלילי והוא מורכב משלושה תחומים מולקולריים: פוליסכריד דיסטלי O-אנטיגן, oligosaccharide ליבה, והשומנים בדם הקרום הקשורים תחום שהופקד על העלון החיצוני של 1,2 bilayer קרום חיצוני. השומנים תחום מורכב משאריות 3-deoxy-D-manno באוק &#39;2-ulosonic (Kdo) ושומני מינים מולקולריים, שבו שומנים בדם יכול להיות מוגדרים כחלק מסיס בכלורופורם של LPS על הידרוליזה מתונה חומצת 1, 2. השומנים סטנדרטיים מולקולה יכולים להיות מוגדרים כימי כמו עמוד השדרה diglucosamine שהוא וbis-פוספורילציה-acylated שש; בקנה אחד עם מיני שומנים העיקריים שנצפו בcoli אורגניזם מודל Escherichia coli (E. coli) 1,2. תשעה גנים הביעו constitutively, נשמרו לאורך כל חיידקים גראם שלילית, הם אחראים לייצור של השומנים בדם תחום (איור 1) 1,2. רוב החיידקים סט נוסף של גנים, אשר משתנה במידת שימור פילוגנטי, המשתתפים בשינוי כימי נוסף של שומנים בדם 3. Dephosphorylation, הסרת חלק מרשתות acyl, והתוספת של moieties הכימי כגון סוכרים אמינו (למשל aminoarabinose) ו / או phosphoethanolamine הן הפעילויות (איור 1) נצפה הנפוצות ביותר. רבים מהאנזימים האחראים לשומני שינוי מופעלים ישירות על ידי אותות סביבתיים, כגון קטיונים דו ערכיים, או הביטוי שלהם מוסדר על ידי שתי מערכות תגובת רגולטור רכיב 3. הכרה של מיני שומנים בדם על ידי מערכת החיסון המולדת המארח מתווכת על ידי גורם הקולטן חיוג כמו בידול 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) שיתוף קולט 4. כוחות הידרופובי בין MD2 והשומנים בדם רשתות acyl, כמו גם בין TLR4 וקבוצות 1 ו -4 &quot;פוספט של שומנים בדם לקדם את הקשר החזק של שפהid עם TLR4/MD2 4,5. שינויים שמשנים את מצב acylation או המטען השלילי של שומנים שומנים מבוססי ההשפעה TLR4/MD2 הכרה וגירוי במורד הזרם של תגובת החיסון המולדת מטהרי NF-κB ומתווכים של דלקת כגון TNFα ו6,7 IL1-β. שינויים שלהסוות את המטען השלילי של שומנים בדם גם למנוע פפטידים מיקרוביאלית קטיוני bactericidal מלהיקשר לגראם שלילי משטחי תא 3,8. שינויי שומנים רבים שיערו להגדיל את כושר חיידקים בתנאים סביבתיים מסוימים, כגון בתוך המארח האנושי או בנישה אקולוגית. מסיבה זו אנזימי שינוי רבים הם מטרות אטרקטיביות בפיתוח רציונלים של תרכובות מיקרוביאלית. הגיוון הכימי של מבני שומנים בדם, ביחס לאורגניזם ו / או בסביבה, ואת ההשלכות הביולוגיות של המבנים המגוונים הללו להפוך את האפיון המבני של שומנים בדם חשוב במאמץ לאהוא לומד של חיידקי גרם שלילי. בידוד של מולקולות שומנים מכל חיידקים כרוך החילוץ של LPS מתא השטח בקטריאלי, צעד hydrolytic לשחרר את השומנים בדם, ואחרי הליך טיהור סופי 9-11. מצוטט לעתים קרובות ביותר הליך מיצוי LPS הוא הליך המיצוי במים החם-פנול, הוצג לראשונה על ידי סטפל וג&#39;אן 10. לאחר כל LPS חילוץ נתונה הידרוליזה מתונה חומצה, אשר כימי מפרידה Kdo מ6&#39;-הידרוקסיל של סוכר גלוקוזאמין הדיסטלי של שומנים בדם (איור 1). החסרונות רבים קיימים להליך המים חם פנול כוללים השימוש במגיב מפגע גבוה, הצורך להשפיל חומצות המופקים במשותף גרעין וחלבונים, וכמה ימים נדרשים כדי להשלים את הפרוטוקול 10. המעבדה שלנו פיתחה עוד יותר את החילוץ ובידוד של שומנים בדם כפי שפותח לראשונה על ידי Caroff וRaetz 12,13. בהשוואה לנהלי מים חם פנול, השיטה המוצגת כאן היא מהירה ויעילה יותר ולהכיל מגוון רחב של נפחי תרבות מ5 מיליליטר לליטר מרובה. יתר על כן, בניגוד לעקירות מים חם פנול, השיטה שלנו לא בוחר למחוספס או חלקת סוגי LPS, מתן התאוששות אופטימלית של מיני שומנים בדם. בפרוטוקול שלנו, תמוגה הכימית של תאי חיידקיים שלמים מתבצעת באמצעות תערובת של כלורופורם, מתנול ומים, שבו ניתן pelleted LPS על ידי צנטריפוגה. שילוב של הידרוליזה מתונה חומצה ועקירות ממס (בליי-Dyer) משמשים לשחרור שומנים מפוליסכריד המצורף קוולנטית. השיטה של ליי ודאייר הוחלה לראשונה המיצוי של מיני שומנים ממגוון רחב של בעלי חיים וצמחי רקמות 14, הותאמו כאן להפריד פוליסכריד שעבר הידרוליזה מא שומנים בדם בשלב הפרדה סופי, שומנים מסיסים כלורופורם לחלק באופן סלקטיבי לאורגניים נמוך שלב. כדי לטהר עוד יותר שומנים בדם, הפוך שלב אוכרומטוגרפיה בעמודת מטבע אניוני יכולה לשמש 12. לאחר הבידוד של מיני שומנים מכל תאים, במספר שיטות אנליטיות יכול לשמש כדי לאפיין את המבנה הכימי של חומר המבודד כגון תמ&quot;ג, TLC, וניתוח המבוסס על MS. NMR מאפשר להבהרה מבנית שאינו הרסנית, ומספק פירוט מבני הקשורים לקשרי glycosidic, הקצאה חד משמעית של עמדות שרשרת acyl, והמחאת האתרים מצורפים לשינויים שומנים בדם כמו aminoarabinose או phosphoethanolamine 15-17. ניתוח NMR של שומנים לא נדון בפרוטוקול שלנו, אבל כבר תאר כראוי במקומות אחרים 15,16. לניתוח מהיר TLC מבוסס שיטות משמשות לעתים קרובות, אך אינו מספק מידע ישיר לגבי מבנה כימי בסדר. פרוטוקולים מבוססים MS הם השיטה המועסק בתדירות הגבוהה ביותר על מנת לאפיין מבני שומנים 18,19. יינון לייזר desorption מטריקס משויך (MALDI)-MS משמש לעתים קרובות בתחילה סקר מיני שומנים בדם בשלמותה. יונים טעונים ביחידים נוצרים מאנליטי נערך בהתאם לנהלי החילוץ שלנו. כפי שנדרש ניתוח מבני עדין יותר, המבוססות על שיטות MS / MS להוכיח אינפורמטיבי יותר מאשר MALDI-MS. מצמידים את electrospray יינון שומנים ביחידים או להכפיל טעונים יונים מבשר הם מקוטעים עוד יותר על ידי ניתוק התנגשות מושרה (CID) או photodissociation אולטרה סגול (UVPD) (ESI), כדי ליצור יוני מוצר מבני אינפורמטיבי 18,20,21. מוצרי אובדן ניטראליים משומנים בדם יונים מבשר גם בתדירות גבוהה שנוצרו במהלך ESI-MS מספקים שכבה נוספת של מידע מבני. ספקטרומטריית טנדם מסה (MS / MS) הוכיחה להיות שיטה הכרחית ותכליתית להבהרה של מבני שומנים בדם. במהלך MS / MS, יונים מופעלים להניב דפוס פיצול אבחון שניתן להשתמש בם על מנת להבהיר את המבנה של יון המבשר. אווה נרחבת ביותרשיטת MS / MS ilable היא CID. שיטה זו מייצרת יונים שבר באמצעות התנגשויות של היונים המבשר הנבחרים עם גז אינרטי יעד, וכתוצאה מכך בתצהיר אנרגיה שמוביל לניתוק. CID הוכיח כלי קריטי בהקצאה של מבנה שומנים בדם למגוון רחב של מיני חיידקים 22-33. למרות CID הוא שיטת MS / MS מיושם ביותר האוניברסלית, זה יוצר מערך מוגבל של יוני מוצר. 193 UVPD ננומטר הוא אלטרנטיבה ושיטת MS / MS משלים. בשיטה זו נעשה שימוש בליזר כדי להקרין יונים, והקליטה של ​​פוטונים התוצאה energization של היונים וניתוק שלאחר מכן. טכניקת MS / MS זה אנרגיה גבוהה יותר מייצרת מערך מגוון יותר של יוני מוצר מאשר CID ובכך מספקת דפוסי פיצול יותר אינפורמטיבי. בפרט, UVPD מעניק מידע על שינויים עדינים במינים שומנים המבוססים על שסעים בglycosidic, אמין, acyl ואיגרות חוב צמודות CC 18,21,34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) הוא המולקולה הגדולה פני תא של חיידקי גרם שלילי, שהופקדה על העלון החיצוני של bilayer הקרום החיצוני. ניתן לחלק LPS לשלושה תחומים: O-פוליסכריד דיסטלי, oligosaccharide ליבה, והשומנים בדם תחום בהיקף של שומנים מינים מולקולריים ושאריות 3-deoxy-D-manno באוק &#39;2-ulosonic חומצה (Kdo). תחום שומנים בדם הוא רק המרכיב חיוני להישרדות תא חיידק. בעקבות הסינתזה שלה, שומנים בדם הוא שינוי כימי בתגובה ללחצים סביבתיים כגון pH או טמפרטורה, כדי לקדם את ההתנגדות לתרכובות אנטיביוטיות, וכדי להתחמק מזיהוי על ידי מתווכים של תגובת החיסון המולדת המארחת. הפרוטוקול המפרט את הבידוד קטן וגדולה בקנה מידה של שומנים בדם מחיידקי גרם שלילי. חומר מבודד מכן מאופיין כימי על ידי כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) או ספקטרומטר מסה (MS). בנוסף למטריקס בסיוע לייזר desorption / יינון פעמי של fאור (MALDI-TOF) טרשת נפוצה, אנו גם מתארים את פרוטוקולי MS מקביל לניתוח שומנים מינים מולקולריים באמצעות יינון electrospray (ESI) מצמידים את ניתוק התנגשות מושרה (CID) וphotodissociation סגול מועסקים חדשים שיטות (UVPD). פרוטוקולי MS שלנו מאפשרים לקביעה חד משמעית של מבנה כימי, בעל חשיבות עליונה לאפיון של מולקולות שומנים המכילות שינויים כימיים ייחודיים או חדשניים. אנו גם מתארים את תיוג radioisotopic, והבידוד שלאחר מכן, של שומנים מתאי חיידקים לניתוח על ידי TLC. יחסית לפרוטוקולים מבוססי MS, TLC מספק שיטת אפיון יותר חסכונית ומהירה, אבל לא ניתן להשתמש בו כדי להקצות באופן חד משמעי שומנים מבנים כימיים ללא השימוש בסטנדרטים של מבנה כימי ידוע. במהלך שני העשורים האחרונים בידוד ואפיון של שומנים בדם הובילו לתגליות מרגשים רבות ששפרו את ההבנה של הפיסיולוגיה של חיידקי גרם שלילי, מנגנונים של התנגדות לאנטיביוטיקה שלנוtance, התגובה החיסונית המולדת האנושית, וספק הרבה מטרות חדשות בפיתוח של תרכובות אנטי בקטריאליים.

שומנים הקנוני של א &#39; Typhimurium serovar enterica coli וסלמונלה הוא דו סוכר-acylated שש של גלוקוזאמין עם קבוצות פוספט ב1 - ו 4 &#39;-עמדות. במהלך צמיחה במדיה עשירה (לדוגמא, מרק לוריא) חלק מהשומנים מכיל קבוצת pyrophosphate ב1-עמדת מניב מיני טריס-פוספורילציה 36 (איור 1).</str...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

בידוד ואפיון של תחום שומנים בדם של lipopolysaccharide (LPS) מחיידקי גרם שלילי מספק תובנה מנגנוני תא שטח על בסיס של עמידות לאנטיביוטיקה, הישרדות והכושר בקטריאלי, ואיך כימי שומנים מגוונים מינים מולקולריים דיפרנציאלי לווסת תגובות חיסוניים מולדים מארחות.

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

רדיקלים חופשיים בביולוגיה כימית: מהתנהגות כימית לפיתוח סמנים ביולוגיים

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

גישה הפוכה ניתוח לאפיון כימי תחבורה בצבעים

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

מסגרות סינתזה ואפיון של פונקציונליות מתכת אורגנית

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

סינתזה ואפיון של קולואידים מולקולריים

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

הכנה והערכה של<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc שכותרתו Tridentate chelates לחינוך קדם-מיקוד שימוש Bioorthogonal לכימיה

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Microfluidic יבש-ספינינג ואפיון של סיבי Fibroin משי מחדש

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

אנזים פיצול-TET2 הנדסה כימית-inducible DNA Hydroxymethylation, שיפוץ Epigenetic

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...