Name: isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00
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यह काम भी JSB को R01GM103655 अनुदान वेल्श फाउंडेशन अनुदान F1155 और एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया स्वास्थ्य (NIH) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान AI064184 और AI76322 द्वारा और MST अनुसंधान करने के लिए सेना के अनुसंधान कार्यालय से अनुदान 61789-Ma-MUR द्वारा समर्थित किया गया

सभी समाधान ultrapure पानी और HPLC ग्रेड मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म के साथ तैयार किया जाना चाहिए. ऐसे मेथनॉल, क्लोरोफॉर्म, या pyridine और केंद्रित एसिड या आधार के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स शामिल तैयार है कि समाधान के लि?...

इस प्रोटोकॉल में हम बैक्टीरिया के पूरे कोशिकाओं से लिपिड एक प्रजाति के अलगाव विस्तृत, और रासायनिक यह अलग सामग्री चिह्नित करने के लिए टीएलसी या एमएस आधारित विश्लेषणात्मक विधियों का वर्णन किया है. अग्र...

(LPS) lipopolysaccharide लगभग सभी ग्राम नकारात्मक जीवों के प्रमुख बाहरी सतह अणु है और तीन आणविक डोमेन के होते हैं: एक बाहर का हे प्रतिजन polysaccharide, एक कोर oligosaccharide, और झिल्ली जुड़े लिपिड की बाहरी पत्रक जमा पर डोमेन बाहरी झिल्ली bilayer 1,2. लिपिड एक डोमेन, लिपिड एक हल्के एसिड हाइड्रोलिसिस 1 पर LPS की क्लोरोफॉर्म घुलनशील भाग के रूप में परिभाषित किया जा सकता है जहां 3 डिओक्सी-D-Manno-Oct-2-ulosonic (KDO) के अवशेष और एक लिपिड एक आणविक प्रजातियों के होते हैं, 2. मॉडल जीव Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) 1,2 में मनाया प्रमुख लिपिड एक प्रजाति के साथ संगत; मानक लिपिड एक अणु रासायनिक hexa-acylated और बीआईएस phosphorylated है कि एक diglucosamine रीढ़ के रूप में परिभाषित किया जा सकता है. ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया भर में संरक्षित नौ रचनात्मक रूप में व्यक्त जीनों, लिपिड का उत्पादन एक डोमेन (चित्रा 1) 1,2 के लिए जिम्मेदार हैं. अधिकांश बैक्टीरिया लिपिड ए 3 के आगे रासायनिक संशोधन में भाग लेने कि वंशावली संरक्षण की डिग्री में भिन्नता है, जो जीन का एक अतिरिक्त सेट,, है. Dephosphorylation, एसाइल जंजीरों को हटाने, और इस तरह के अमीनो शर्करा (जैसे aminoarabinose) और / या phosphoethanolamine के रूप में रासायनिक moieties के अलावा सबसे अधिक देखी गतिविधियों (चित्रा 1) हैं. लिपिड एक संशोधन के लिए जिम्मेदार एंजाइम से कई सीधे द्विसंयोजक फैटायनों के रूप में पर्यावरण के संकेत, द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, या उनकी अभिव्यक्ति दो घटक प्रतिक्रिया नियामक प्रणालियों 3 द्वारा नियंत्रित किया जाता है. मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा लिपिड एक प्रजाति की मान्यता टोल की तरह रिसेप्टर 4/myeloid भेदभाव कारक 2 (TLR4/MD2) सह रिसेप्टर 4 द्वारा मध्यस्थता है. MD2 और लिपिड एक एसाइल चेन, साथ ही TLR4 और लिपिड एक की 1 और 4 &#39;फॉस्फेट समूहों होंठ के मजबूत सहयोग को बढ़ावा देने के बीच के बीच हाइड्रोफोबिक बलोंTLR4/MD2 4,5 साथ आईडी ए. Acylation राज्य या लिपिड के नकारात्मक प्रभारी एक प्रभाव TLR4/MD2 आधारित लिपिड को बदलने वाले संशोधनों के एक मान्यता और सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बहाव उत्तेजना NF-κB और ऐसे TNFα और IL1-β 6,7 के रूप में सूजन के मध्यस्थों activators. लिपिड एक के नकारात्मक आरोप नकाब कि संशोधन भी सेल सतहों 3,8 नकारात्मक ग्राम के लिए बाध्य करने से जीवाणुनाशक cationic रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स रोका जा सके. कई लिपिड एक संशोधनों ऐसे मानव मेजबान अंदर है या एक पारिस्थितिक आला में के रूप में विशिष्ट पर्यावरण की स्थिति, के तहत बैक्टीरियल फिटनेस बढ़ाने के लिए धारणा रहे हैं. इस कारण से कई संशोधन एंजाइमों रोगाणुरोधी यौगिकों के तर्कसंगत विकास में आकर्षक लक्ष्य कर रहे हैं. लिपिड एक संरचनाओं के रासायनिक विविधता, जीव और / या पर्यावरण, और इन विविध संरचनाओं का जैविक प्रभाव के संबंध में लिपिड एक की संरचनात्मक लक्षण वर्णन टी में एक महत्वपूर्ण प्रयासवह ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया का अध्ययन करते हैं. पूरे बैक्टीरिया से लिपिड एक अणुओं का अलगाव एक अंतिम शोधन प्रक्रिया 9-11 द्वारा पीछा बैक्टीरिया कोशिका की सतह से LPS की निकासी, लिपिड एक आजाद कराने के लिए एक hydrolytic कदम शामिल है. सबसे अक्सर उद्धृत LPS निष्कर्षण प्रक्रिया पहले Westphal और Jann 10 से शुरू की, गर्म फिनोल पानी निकासी प्रक्रिया है. निकासी पूरी LPS रासायनिक लिपिड एक के बाहर का glucosamine चीनी (चित्रा 1) के 6&#39;-हाइड्रॉक्सिल से KDO जो अलग हल्के एसिड हाइड्रोलिसिस, के अधीन है, के बाद. कई नुकसान एक उच्च खतरा अभिकर्मक के उपयोग सहित गर्म फिनोल पानी की प्रक्रिया के लिए मौजूद हैं, सह निकाले न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन, और कई दिनों से नीचा करने की जरूरत प्रोटोकॉल 10 पूरा करना आवश्यक है. पहले Caroff और Raetz 12,13 द्वारा विकसित रूप में हमारी प्रयोगशाला आगे लिपिड एक की निकासी और अलगाव विकसित की है. गर्म फिनोल पानी प्रक्रियाओं की तुलना में, यहाँ प्रस्तुत विधि और अधिक तेजी से और कुशल है और 5 मिलीग्राम से कई लीटर संस्कृति संस्करणों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है. इसके अलावा, गर्म फिनोल पानी एक्सट्रेक्शन के विपरीत, हमारे विधि लिपिड एक प्रजाति के इष्टतम वसूली प्रदान करने, LPS के किसी न किसी या चिकनी प्रकार के लिए चयन नहीं होता है. हमारे प्रोटोकॉल में, पूरे बैक्टीरियल कोशिकाओं के रासायनिक सेल LPS centrifugation द्वारा pelleted किया जा सकता है, जहां क्लोरोफॉर्म, मेथनॉल और पानी के मिश्रण का प्रयोग किया जाता है. हल्के एसिड hydrolysis और विलायक एक्सट्रेक्शन (Bligh-डायर) का एक संयोजन covalently संलग्न polysaccharide से लिपिड एक आजाद कराने के लिए उपयोग किया जाता है. Bligh और डायर की विधि पहले 14 ऊतकों, पशु और संयंत्र की एक किस्म से लिपिड प्रजातियों की निकासी के लिए लागू इस अंतिम जुदाई चरण में लिपिड ए से hydrolyzed पोलीसेकेराइड अलग करने के लिए यहाँ संशोधित किया गया था, क्लोरोफॉर्म घुलनशील लिपिड चुनिंदा कम जैविक में विभाजन चरण. इसके अलावा, लिपिड एक शुद्ध करने के लिए रिवर्स चरण याanionic विनिमय कॉलम क्रोमैटोग्राफी 12 इस्तेमाल किया जा सकता है. पूरे कोशिकाओं से लिपिड एक प्रजाति के अलगाव के बाद, विश्लेषणात्मक तरीकों की एक संख्या में इस तरह के एनएमआर, टीएलसी, और एमएस के आधार पर विश्लेषण के रूप में अलग सामग्री की रासायनिक संरचना को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एनएमआर गैर विनाशकारी संरचनात्मक व्याख्या के लिए अनुमति देता है, और glycosidic लिंकेज, एसाइल श्रृंखला पदों की स्पष्ट असाइनमेंट, और aminoarabinose या phosphoethanolamine 15-17 जैसे लिपिड एक संशोधन के लिए लगाव साइटों के काम से संबंधित ढांचागत विस्तार प्रदान करता है. लिपिड एक की एनएमआर विश्लेषण हमारे प्रोटोकॉल के भीतर चर्चा नहीं है, लेकिन कहीं 15,16 पर्याप्त रूप से वर्णित किया गया है. तेजी से विश्लेषण के लिए टीएलसी तरीकों अक्सर इस्तेमाल किया जाता है आधारित है, लेकिन ठीक रासायनिक संरचना के बारे में प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान करने में विफल. एमएस आधारित प्रोटोकॉल लिपिड एक संरचनाओं 18,19 चिह्नित करने के लिए सबसे अक्सर कार्यरत तरीका है. मैट्रिक्स जुड़े लेजर desorption आयनीकरण (MALDI) एमएस अक्सर शुरू में बरकरार लिपिड एक प्रजाति सर्वेक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अकेले आयनों का आरोप लगाया analyte हमारे निष्कर्षण प्रक्रिया के अनुसार तैयार से उत्पन्न कर रहे हैं. अधिक ठीक संरचनात्मक विश्लेषण आवश्यक है, एमएस / एमएस आधारित विधियों MALDI एमएस से अधिक जानकारीपूर्ण साबित होते हैं. संरचनात्मक रूप से जानकारीपूर्ण उत्पाद आयनों 18,20,21 उत्पन्न करने के लिए, (ईएसआई) का पूर्वाभ्यास आयनों की टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) या पराबैंगनी photodissociation (UVPD) से आगे खंडित कर रहे हैं अकेले या गुणा आरोप लगाया लिपिड आयनीकरण electrospray के लिए युग्मित. एक अग्रदूत के आयनों लिपिड से तटस्थ नुकसान उत्पादों को भी अक्सर संरचनात्मक जानकारी का एक अतिरिक्त परत प्रदान ईएसआई एमएस दौरान उत्पन्न कर रहे हैं. अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) लिपिड एक संरचनाओं की व्याख्या के लिए एक अनिवार्य और बहुमुखी विधि साबित हो गया है. एमएस / एमएस के दौरान, आयनों अग्रदूत आयन की संरचना को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक नैदानिक ​​विखंडन पैटर्न उपज को सक्रिय कर रहे हैं. सबसे व्यापक रूप से शुक्रियाilable एमएस / एमएस विधि सीआईडी ​​है. इस विधि हदबंदी की ओर जाता है कि ऊर्जा बयान में जिसके परिणामस्वरूप, एक आभ्यांतरिक लक्ष्य गैस के साथ चयनित अग्रदूत आयन की टक्कर के माध्यम से टुकड़ा आयनों पैदा करता है. सीआईडी ​​बैक्टीरियल प्रजातियों 22-33 की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लिपिड संरचना के काम में एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है. सीआईडी ​​सबसे सार्वभौमिक कार्यान्वित एमएस / एमएस विधि है, यद्यपि यह उत्पाद आयनों की एक सीमित सरणी उत्पन्न करता है. 193 एनएम UVPD एक वैकल्पिक और पूरक एमएस / एमएस विधि है. इस विधि आयनों को चमकाना एक लेजर का उपयोग करता है, और फोटॉनों का अवशोषण आयनों और बाद हदबंदी के विद्युतीकरण में यह परिणाम है. इस उच्च ऊर्जा एमएस / एमएस तकनीक सीआईडी ​​से उत्पाद आयनों की एक अधिक विविध सरणी पैदा करता है और इस प्रकार अधिक जानकारीपूर्ण विखंडन पैटर्न प्रदान करता है. विशेष रूप से, UVPD glycosidic, amine एसाइल और सीसी जुड़े बांड 18,21,34 में चोली पर आधारित लिपिड एक प्रजाति में सूक्ष्म परिवर्तनों के बारे में जानकारी देता है.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

(LPS) lipopolysaccharide बाहरी झिल्ली bilayer के बाहरी पत्रक जमा पर ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के प्रमुख कोशिका की सतह अणु, है. LPS तीन डोमेन में विभाजित किया जा सकता है: बाहर हे polysaccharide, एक कोर oligosaccharide, और लिपिड एक लिपिड से मिलकर एक डोमेन एक आणविक प्रजातियों और 3 डिओक्सी-D-Manno-Oct-2-ulosonic एसिड के अवशेष (KDO). लिपिड एक डोमेन बैक्टीरिया कोशिका अस्तित्व के लिए आवश्यक केवल घटक है. इसके संश्लेषण के बाद, लिपिड एक रासायनिक एंटीबायोटिक यौगिकों के लिए प्रतिरोध को बढ़ावा देने के लिए, और मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मध्यस्थों द्वारा मान्यता से बचने के लिए, पीएच या तापमान के रूप में पर्यावरण तनाव के जवाब में संशोधित किया गया है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से लिपिड ए के छोटे और बड़े पैमाने पर अलगाव का विवरण. पृथक सामग्री तो रासायनिक पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) या जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) की विशेषता है. इसके अलावा एफ के लेजर desorption / आयनीकरण समय मैट्रिक्स की मदद सेप्रकाश (MALDI-TOF) एमएस, हम भी टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) के लिए युग्मित electrospray ionization (ईएसआई) और नव नियोजित पराबैंगनी photodissociation (UVPD) तरीकों का उपयोग लिपिड एक आणविक प्रजातियों का विश्लेषण करने के लिए मिलकर एमएस प्रोटोकॉल का वर्णन. हमारे एमएस प्रोटोकॉल अद्वितीय या उपन्यास रासायनिक संशोधनों होते हैं कि लिपिड एक अणु के लक्षण वर्णन के लिए सर्वोपरि, रासायनिक संरचना का स्पष्ट निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं. हम भी टीएलसी द्वारा विश्लेषण के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं से लिपिड एक की रेडियोआइसोटोपिक लेबलिंग, और बाद में अलगाव का वर्णन. एमएस आधारित प्रोटोकॉल के सापेक्ष, टीएलसी एक और अधिक किफायती और तेजी से लक्षण वर्णन तरीका प्रदान करता है, लेकिन स्पष्ट रूप से ज्ञात रासायनिक संरचना के मानकों के उपयोग के बिना एक रासायनिक संरचना लिपिड आवंटित करने के लिए प्रयोग नहीं किया जा सकता है. पिछले दो दशकों में लिपिड एक का अलगाव और लक्षण वर्णन ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया, एंटीबायोटिक प्रतिरोध के तंत्र का शरीर विज्ञान के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है कि कई रोमांचक खोजों के लिए प्रेरित कियादूरी, मानव सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और जीवाणुरोधी यौगिकों के विकास में कई नए लक्ष्य प्रदान की है.

ई. के विहित लिपिड एक और 4 &#39;पदों - कोलाई और साल्मोनेला enterica serovar typhimurium एक hexa-acylated 1 में फॉस्फेट समूहों के साथ glucosamine की disaccharide है. अमीर मीडिया (जैसे Luria शोरबा) में वृद्धि के दौरान लिपिड ए के एक हिस्से को एक Tri...

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से (LPS) lipopolysaccharide के लिपिड किसी डोमेन का अलगाव और लक्षण वर्णन कोशिका की सतह एंटीबायोटिक प्रतिरोध के आधार पर तंत्र, बैक्टीरियल अस्तित्व और फिटनेस, और कैसे रासायनिक विविध लिपिड एक आणविक प्रजातियों विभिन्न मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मिलाना में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से अलगाव और लिपिड एक के रासायनिक लक्षण वर्णन

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

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