Name: isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd AI064184 og AI76322 fra National Institutes of Health (NIH), og ved Grant 61789-MA-MUR fra Army Research Office til MST Forskning ble også støttet av Welch Foundation Grant F1155 og NIH gi R01GM103655 til JSB

Alle løsningene bør bli fremstilt med ultrarent vann, og HPLC-kvalitet metanol og kloroform. Preparerte oppløsninger som inneholder organiske oppløsningsmidler slik som metanol, kloroform eller pyridin, og konsentrerte syrer eller baser skal fremstilles og brukes i henhold til et avtrekksskap. Alle løsningene kan bli lagret ved romtemperatur. Løse skal måles i en gradert glassylinder og lagret i glassflasker med løsemiddel PTFE-foret caps. For langtidslagring kloroform-holdige oppløsningsmidler bør lagres i to...

I denne protokollen har vi inngående isolering av lipid A arter fra hele celler av bakterier, og beskrev TLC eller MS baserte analytiske metoder til kjemisk karakter dette isolerte materialet. Tandem massespektrometri er en kraftfull strategi for de novo strukturell karakterisering av biologiske forbindelser, og er verdifull for den kjemiske karakterisering av panoply av lipid A-molekyler som observeres i naturen. CID og UVPD er to komplementære aktiveringsmetoder som skaper ulike typer produktioner som gir v...

Lipopolysakkarid (LPS) er en hoved ytterflate molekyl av nesten alle gram-negative organismer, og består av tre molekylære domener: en distal O-antigen polysakkarid, en kjerne oligosakkarid, og den membran-assosiert lipid A domain avsatt på den ytre paknings av ytre membran-dobbeltlag 1,2. De lipid A domenet består av 3-deoksy-D-manno-okt-2-ulosonic (Kdo) rester og en lipid A-molekylære arter, der lipid A kan defineres som kloroform oppløselig del av LPS ved mild syrehydrolyse 1, 2. Standarden lipid A-molekylet kan være kjemisk definert som en diglucosamine ryggrad som er hexa-acylerte og bis-fosforylert, i overensstemmelse med de store lipid A-artene ble observert i modellen organismen Escherichia coli (E. coli) 1,2. Ni konstitutivt uttrykte gener, som bevares i hele gram-negative bakterier, er ansvarlig for produksjonen av lipid A domene (figur 1) 1,2. De fleste bakterier har et ekstra sett med gener, som varierer i grad av fylogenetisk bevaring, som deltar i ytterligere kjemisk modifikasjon av lipid A 3. Dephosphorylation, fjerning av acylkjeder, og tilsetning av kjemiske rester som for eksempel amino-sukkere (f.eks aminoarabinose) og / eller phosphoethanolamine er de mest vanlig observerte aktiviteter (figur 1). Mange av de enzymer som er ansvarlige for lipid A modifikasjon blir direkte aktivert av miljøsignaler, slik som divalente kationer, eller deres ekspresjon er regulert av to komponent-regulator-systemer reaksjon 3. Anerkjennelse av lipid A arter av verten medfødte immunsystemet er mediert av Toll-like receptor 4/myeloid differensiering faktor 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Hydrofobe krefter mellom MD2 og lipid A acylkjeder, så vel som mellom TLR4 og 1 og 4 &#39;fosfatgruppene lipid A fremmer sterke assosiasjon av leppenid A med TLR4/MD2 4,5. Modifikasjoner som endrer acyleringen staten eller negativ ladning av lipid A innvirkning TLR4/MD2 basert lipid En anerkjennelse og nedstrøms stimulering av det medfødte immunrespons aktivatorer NF-κB og mediatorer av inflammasjon som TNF-alfa og IL1-β 6,7. Modifikasjoner som maskere den negative ladningen av lipid A også hindre bakteriedrepende kationiske antimikrobielle peptider fra binding til gram-negative celleoverflater 3,8. Mange lipid A modifikasjoner er antatt å øke bakterie fitness under spesielle miljøforhold, for eksempel inne i menneske host eller i en økologisk nisje. Av denne grunn er mange modifikasjonsenzymer er attraktive mål på rasjonell utvikling av antimikrobielle forbindelser. Den kjemiske mangfold av lipid A-strukturer, med hensyn til organismer og / eller omgivelser, og de biologiske virkningene av disse forskjellige strukturer gjør strukturell karakterisering av lipid A en viktig oppgave i tHan studere av gram-negative bakterier. Isolering av lipid A-molekyler fra hele bakterier omfatter utvinning av LPS fra bakteriecelleoverflaten, et hydrolytisk trinn å frigjøre lipid A, etterfulgt av en avsluttende renseprosess 9-11. Den hyppigst siterte LPS utvinning prosedyren er hot-fenol vann utvinning prosedyre, først introdusert av Westphal og Jann 10. Etter ekstraksjon hele LPS underkastes mild sur hydrolyse, som er kjemisk skiller Kdo fra 6&#39;-hydroksyl av det distale glukosamin sukker av lipid A (figur 1). Mange fallgruver finnes for det varme-fenol vann prosedyre inkludert bruk av en høy fare reagens, blir behovet for å degradere ko-ekstraherte nukleinsyrer og proteiner, og flere dager for å fullføre protokoll 10.. Vårt laboratorium har videreutviklet utvinning og isolering av lipid A som først utviklet av Caroff og Raetz 12,13. Sammenlignet med varm fenol-vann-fremgangsmåten, idet fremgangsmåten er presentert her er raskere og mer effektiv, og kan tilpasses en lang rekke kulturvolumer fra 5 ml til flere liter. Videre, i motsetning til hot-fenol vann utdrag, ikke vår metode velger ikke for grov-eller glatt-typer av LPS, som gir optimal utvinning av lipid A arter. I vår-protokollen, er kjemisk lysering av hele bakterieceller utført med en blanding av kloroform, metanol og vann, hvor LPS kan bli pelletert ved sentrifugering. En kombinasjon av mild syrehydrolyse og oppløsnings ekstraksjoner (Bligh-Dyer) blir brukt til å frigjøre lipid A fra kovalent bundet polysakkarid. Metoden med Bligh and Dyer ble først brukt til utvinning av fettarter fra en rekke dyre-og plantemateriale 14, modifisert her for å separere hydrolysert polysakkarid fra lipid A. I denne siste separasjonstrinn, kloroform oppløselige lipider selektivt fordeles i det nedre organiske fase. For ytterligere å rense lipid A, revers-fase elleranionisk bytterkolonne-kromatografi kan anvendes 12. Etter isolering av lipid A-arter fra hele celler, kan anvendes en rekke analysemetoder for å karakterisere den kjemiske strukturen av det isolerte materiale, slik som NMR, TLC og MS-baserte analyser. NMR gir mulighet for ikke-destruktiv strukturoppklaring, og gir strukturelle detaljer knyttet til glykosid bindinger, entydig tildeling av acylkjede stillinger, og tildeling av festeplasser for lipid A modifikasjoner som aminoarabinose eller phosphoethanolamine 15-17. NMR-analyse av lipid A er ikke diskutert i vår protokollen, men er blitt beskrevet andre steder tilstrekkelig 15,16. For rask analyse TLC baserte metoder brukes ofte, men ikke klarer å gi direkte informasjon om fine kjemiske struktur. MS baserte protokoller som er mest hyppig brukt metode for å karakterisere lipid A strukturer 18,19. Matrix forbundet laser desorpsjon ionisering (MALDI)-MS er ofte brukt til utgangspunktet kartlegge intakte lipid A arter. Enkeltvis ladede ioner genereres fra analytten fremstilt i henhold til vår ekstraksjonsmetoder. Som kreves flere fine strukturanalyse, MS / MS-baserte metoder bevise mer informativ enn MALDI-MS. Koplet til Elektro ionisering (ESI) enkeltvis eller formere ladet lipid en forløper ioner er ytterligere fragmentert ved kollisjon indusert dissosiasjon (CID) eller ultrafiolett photodissociation (UVPD), å generere strukturelt informative produktioner 18,20,21. Nøytrale tap produkter fra Lipid en forløper ioner er også ofte genereres under ESI-MS som gir et ekstra lag med strukturell informasjon. Tandem massespektrometri (MS / MS) har vist seg å være et uunnværlig og allsidig fremgangsmåte for belysning av lipid A-strukturer. Under MS / MS, blir ioner aktiveres for å gi en diagnostisk fragmenteringsmønster som kan brukes til å belyse den strukturen av forløperen ion. Den mest available MS / MS metoden er CID. Denne metoden gir fragmentioner via kollisjoner av den valgte forløper ion med en inert target gass, noe som er energi nedfall som fører til dissosiasjon. CID har vist seg en kritisk verktøy for tildeling av lipid A struktur for et bredt spekter av bakteriearter 22-33. Selv CID er den mest universelt implementert MS / MS metoden, genererer det et begrenset utvalg av produktioner. 193 nm UVPD er et alternativ, og komplementære MS / MS-metode. Denne metoden benytter en laser for å bestråle ioner, og absorpsjon av fotoner resulterer i energisering av ioner og etterfølgende dissosiasjon. Denne høyere energi MS / MS teknikk gir en mer variert utvalg av produkt ioner enn CID og dermed gir mer informative fragmentering mønstre. Spesielt gir UVPD informasjon om subtile endringer i lipid A arter basert på splittelsene i glycosidic, amin, acyl og CC indeksobligasjoner 18,21,34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

Lipopolysakkarid (LPS) er en viktig celleoverflate-molekyl av gram-negative bakterier, avsettes på den ytre paknings av den ytre membran-dobbeltlag. LPS kan deles inn i tre domener: den distale O-polysakkarid, en kjerne oligosakkarid, og lipid A domene som består av en lipid A-molekylære arter og 3-deoksy-D-manno-okt-2-ulosonic ester (KDO). De lipid A-domenet er den eneste komponent avgjørende for bakteriecelleoverlevelse. Etter at syntesen er lipid A kjemisk modifisert som reaksjon på ytre påvirkninger som for eksempel pH-verdi eller temperatur, for å fremme resistens mot antibiotika forbindelser, og for å unngå gjenkjennelse av mediatorer av verten medfødte immunrespons. Den følgende protokoll beskriver liten og stor skala isolering av lipid A fra gram-negative bakterier. Isolert materiale blir deretter kjemisk karakterisert ved tynnsjiktskromatografi (TLC) eller masse-spektrometri (MS). I tillegg til matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering-tid på flys (MALDI-TOF) MS, vi også beskrive tandem MS protokoller for å analysere lipid A molekylære arter ved hjelp av electro ionisering (ESI) koplet til kollisjon indusert dissosiasjon (CID) og nytilsatte ultrafiolett photodissociation (UVPD) metoder. Våre MS protokoller tillate utvetydig bestemmelse av kjemisk struktur, viktig å karakterisering av lipid A molekyler som inneholder unike eller nye kjemiske modifikasjoner. Vi beskriver også en radioisotopisk merking, og etterfølgende isolering, med lipid A fra bakterielle celler for analyse ved hjelp av TLC. I forhold til MS-baserte protokoller, gir TLC en mer økonomisk og hurtig karakterisering metode, men kan ikke brukes til å tilordne entydig lipid A kjemiske strukturer uten anvendelse av standarder med kjent kjemisk struktur. I løpet av de siste to tiårene isolering og karakterisering av lipid A har ført til en rekke spennende funn som har gitt bedre kunnskap om fysiologi av gramnegative bakterier, mekanismer for antibiotika motstandheten, menneskets medfødte immunrespons, og har gitt mange nye mål i utviklingen av antibakterielle forbindelser.

Canonical lipid A til E. coli-og Salmonella ente serovar typhimurium er et hexa-acylert disakkarid av glukosamin med fosfatgrupper i 1 - og 4 &#39;-stillingene. Under vekst i rike medier (f.eks Luria Broth) en del av lipid A inneholder et pyrofosfat-gruppe ved 1-stillingen som gir en Tris-fosforylert arter 36 (figur 1). Kdo (3-deoxy-D-manno-octulosonic syre), er festet på 6&#39;-hydroksyl og tjener som en bro for å koble lipid A til de gjenværende karboh...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolering og karakterisering av lipid Et domene av lipopolysakkarid (LPS) fra gramnegative bakterier gir innsikt i celleoverflatebaserte mekanismer for antibiotikaresistens, bakteriell overlevelse og fitness, og hvordan kjemisk mangfoldig lipid A molekylære arter differentially modulere vert medfødte immunresponser.

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A fra Gram-negative bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Frie radikaler i Chemical Biology: fra Kjemisk Behavior til utvikling av biomarkører

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Folding og karakterisering av en Bio-responsive Robot fra DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nukleosidtrifosfater - Fra Synthesis til Biokjemisk karakterisering

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

En invers Analyse Tilnærming til Karakterisering av Chemical Transport i Maling

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntese og karakterisering av funksjon Metal-organisk Rammeverk

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forbereder Adherent Cells for X-ray fluorescens Imaging ved Kjemisk Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering av supra Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Utarbeidelse og evaluering av<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-merket tredentat Chelates for Pre-måls Bruke Bioorthogonal kjemi

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Microfluidic tørr-spinning og karakterisering av gjenfødte silke Fibroin fiber

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

En konstruert Split-TET2 enzymet for kjemisk-induserbart DNA Hydroxymethylation og Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...