Name: isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag AI064184 och AI76322 från National Institutes of Health (NIH) och av Grant 61789-MA-MUR från Army Research Office till MST forskning stöddes också av Welch Foundation Grant F1155 och NIH bevilja R01GM103655 till JSB

Alla lösningar skall beredas med ultrarent vatten och HPLC-kvalitet metanol och kloroform. Beredda lösningar som innehåller organiska lösningsmedel, såsom metanol, kloroform eller pyridin och koncentrerade syror eller baser bör framställas och användas inom ramen för ett kemiskt dragskåp. Alla lösningar kan lagras vid rumstemperatur. Lösningsmedel ska mätas i en graderad glascylinder och förvaras i glaslösningsmedelsflaskor med PTFE-fodrade mössor. För långtidslagring kloroform-innehållande lösningsm...

I detta protokoll har vi detaljerade isolering av lipid A arter från hela celler av bakterier, och beskrev TLC eller MS baserade analysmetoder för att kemiskt karakterisera denna isolerade material. Tandem masspektrometri är en kraftfull strategi för de novo strukturell karakterisering av biologiska ämnen, och är ovärderlig för den kemiska karakterisering av arsenalen av lipid A-molekyler som finns i naturen. CID och UVPD är två kompletterande aktiveringsmetoder som skapar olika typer av produktjoner ...

Lipopolysackarid (LPS) är den huvudsakliga yttre ytan molekyl av nästan alla gramnegativa organismer och består av tre molekylära domäner: en bortre O-antigen polysackarid, en kärna oligosackarid, och membranassocierade lipid A-domänen avsatt på den yttre bipacksedel för yttre membrandubbelskikt 1,2. Den lipid En domän består av 3-deoxi-D-manno-okt-2-ulosonic (KDO) rester och en lipid en molekyl, där lipid A kan definieras som den kloroform lösliga delen av LPS vid mild-sur hydrolys 1, 2. Standarden lipid A-molekylen kan kemiskt definieras som en diglucosamine ryggrad som är hexa-acylerade och bis-fosforylerade; konsekvent med de stora lipid A arterna observerade i modellorganismen Escherichia coli (E. coli) 1,2. Nio konstitutivt uttryckta gener, konserverade hela gramnegativa bakterier, är ansvariga för produktionen av lipid A domän (Figur 1) 1,2. De flesta bakterier som har en ytterligare uppsättning av gener, som varierar i grad av fylogenetisk konservering, att delta i ytterligare kemisk modifiering av lipid A-3. Defosforylering, borttagning av acylkedjor, och tillsats av kemiska delar såsom aminosocker (t.ex. aminoarabinose) och / eller fosfoetanolamin är de vanligast observerade aktiviteter (Figur 1). Många av de enzymer som ansvarar för lipid A modifiering påverkas direkt av miljösignaler, såsom divalenta katjoner, eller deras uttryck regleras av två komponent respons-regulatorsystem 3. Erkännande av lipid A arter av värd medfödda immunsystemet förmedlas av Toll-like receptor 4/myeloid differentieringsfaktor 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Hydrofoba krafter mellan MD2 och lipid A acylkedjorna, liksom mellan TLR4 och 1 och 4 &#39;fosfatgrupper av lipid A främja stark sammanslutning av läppid A med TLR4/MD2 4,5. Ändringar som förändrar acyle stat eller den negativa laddningen av lipid A inverkan TLR4/MD2 baserad lipid Ett erkännande och nedströms stimulering av det medfödda immunsvaret aktivatorer NF-kB och mediatorer av inflammation såsom TNF och IL1-β 6,7. Ändringar som döljer den negativa laddningen av lipid A förhindrar också bakteriedödande katjoniska antimikrobiella peptider från att binda till gram-negativa cellytor 3,8. Många lipid A ändringar hypotes att öka bakterie kondition under specifika miljöförhållanden, som t.ex. inuti den mänskliga värden eller i en ekologisk nisch. Av denna anledning många modifierings enzymer är attraktiva mål i en rationell utveckling av antimikrobiella föreningar. Den kemiska mångfalden av lipid A strukturer med avseende på organism och / eller miljö, och de biologiska konsekvenserna av dessa olika strukturer gör strukturbestämning av lipid A en viktig strävan itHan studerar för gramnegativa bakterier. Isolering av lipid A-molekyler från hela bakterier involverar extraktion av LPS från bakteriecellytan, ett hydrolytiskt steg för att befria lipid A, följt av en slutlig reningsförfarande 9-11. Den oftast citerade LPS extraktionsförfarande är den varm fenol vattenuttag förfarande, först introducerades av Westphal och Jann 10. Efter extraktion hela LPS utsattes för mild syrahydrolys, vilket kemiskt separerar Kdo från 6&#39;-hydroxylgruppen av den distala glukosaminsocker av lipid A (figur 1). Många fallgropar finns för varm fenol vatten förfarande inklusive användning av en hög risk reagens, är behovet av att bryta ned co-extraherade nukleinsyror och proteiner, och flera dagar krävs för att slutföra protokollet 10. Vårt labb har vidareutvecklat extraktion och isolering av lipid A som först utvecklades av Caroff och Raetz 12,13. Jämfört med varmfenol vatten förfaranden, är den metod som presenteras här mer snabb och effektiv och rymmer ett brett utbud av kulturvolymer från 5 ml till flera liter. Till skillnad från hot-fenol vatten extraktioner, vår metod inte välja för grov-eller släta typer av LPS, som ger optimal återhämtning av lipid A-arter. I vårt protokoll, kemisk lys av hela bakteriella celler utfördes med användning av en blandning av kloroform, metanol och vatten, där LPS kan pelleteras genom centrifugering. En kombination av mild syrahydrolys och lösningsmedelsextraktionerna (Bligh-Dyer) används för att befria lipid A från kovalent bunden polysackarid. Metoden för Bligh och Dyer först tillämpades till utvinning av fettarter från en mängd olika djur-och växtvävnader 14, modifierat här att skilja hydrolyserad polysackarid från lipid A. I denna sista separationssteget, kloroform lösliga lipider selektivt fördelas i den lägre organiska fas. För att ytterligare rena lipid A, omvänd-fas elleranjonbytar-kolonnkromatografi kan användas 12. Efter isolering av lipid A-arter från hela celler, kan ett antal analytiska metoder användas för att karakterisera den kemiska strukturen hos det isolerade material, såsom NMR, TLC och MS-baserad analys. NMR möjliggör icke-förstörande strukturell belysning, och ger strukturell detalj i samband med glykosidlänkar, entydig tilldelning av acylkedja positioner och tilldelning av fästplatser för lipid A modifieringar som aminoarabinose eller fosfoetanolamin 15-17. NMR-analys av lipid A diskuteras inte i våra protokoll, men har beskrivits på lämpligt sätt på andra ställen 15,16. För snabb analys TLC baserade metoder används ofta, men misslyckas med att ge direkt information om fina kemiska struktur. MS baserade protokoll är de ofta används metoden att karaktärisera lipid A strukturer 18,19. Matrix associeras laserdesorptionsjonisering (MALDI)-MS används ofta för att inledningsvis kart intakta lipid A arterna. Enkelladdade joner genereras från analyt framställd enligt våra extraktionsmetoder. När fler fina strukturell analys krävs, MS / MS-baserade metoder visa sig vara mer informativa än MALDI-MS. Kopplat till elektrosprayjonisering (ESI) för sig eller multiplicera laddad lipid A prekursor joner är dessutom splittrad genom kollision inducerad dissociation (CID) eller ultraviolett photodissociation (UVPD), för att generera strukturellt informativa produktjoner 18,20,21. Neutrala produkter förlust från lipid A-prekursor joner också ofta genereras under ESI-MS ger ett extra lager av strukturell information. Tandem masspektrometri (MS / MS) har visat sig vara en nödvändig och mångsidig metod för att klarlägga lipid A-strukturer. Under MS / MS, joner aktiveras för att ge ett diagnostiskt fragmenteringsmönster som kan användas för att belysa strukturen av moderjon. Den mest available MS / MS-metoden är CID. Denna metod ger fragmentjoner via kollisioner i den valda moderjon med en inert mål gas, vilket resulterar i energi nedfall som leder till dissociation. CID har visat sig vara ett viktigt verktyg i tilldelningen av lipid En struktur för ett stort antal bakteriearter 22-33,. Även CID är den mest allmänt implementeras MS / MS-metod, genererar det en begränsad uppsättning av produktjoner. 193 nm UVPD är ett alternativ och komplement MS / MS metoden. Denna metod använder en laser för att bestråla joner, och absorptionen av fotoner resulterar i aktivering av de joner och efterföljande dissociation. Denna högre energi MS / MS-teknik ger ett mer varierat utbud av produktjoner än CID och därmed ger mer informativa fragmenteringsmönster. Framför allt ger UVPD information om subtila förändringar i lipid En art som baseras på klyvningar vid glykosidbindning, amin, acyl och CC obligationer 18,21,34.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

Lipopolysackarid (LPS) är den huvudsakliga cellytemolekyl av gramnegativa bakterier som är anbragta på den yttre bipacksedel av yttermembrandubbelskiktet. LPS kan delas in i tre områden: det distala O-polysackarid, en kärna oligosackarid och lipid A-domänen bestående av en lipid A-molekylslag och 3-deoxi-D-manno-okt-2-ulosonic syrarester (KDO). Den lipid En domän är den enda som är väsentligt för bakteriell cellöverlevnad. Efter dess syntes, är lipid A kemiskt modifierad som svar på miljöstress, såsom pH eller temperatur, till ökad resistens till antibiotiska föreningar, och för att undgå igenkänning av mediatorer av värdens naturliga immunsvar. Följande protokoll specificerar små och storskalig isolering av lipid A från gramnegativa bakterier. Isolerade materialet sedan kemiskt karaktäriseras av tunnskiktskromatografi (TLC) eller masspektrometri (MS). Förutom matris-assisterad laser desorption / jonisering-tid av fljus (MALDI-TOF) MS beskriver vi även tandem MS-protokoll för att analysera lipid A molekylslag med hjälp av elektro (ESI) kopplat till kollision inducerad dissociation (CID) och nyanställd ultraviolett photodissociation (UVPD) metoder. Vår MS-protokoll tillåter entydig bestämning av kemisk struktur, avgörande för karakterisering av lipid A-molekyler som innehåller unika eller nya kemiska modifieringar. Vi beskriver också den radioisotopmärkning, och efterföljande isolering, av lipid A från bakterieceller för analys med TLC. I förhållande till MS-baserade protokoll, ger TLC en mer ekonomisk och snabb karaktärisering metod, men kan inte användas för att entydigt tilldela lipid A kemiska strukturer utan användning av standarder med känd kemisk struktur. Under de senaste två decennierna isolering och karakterisering av lipid A har lett till många spännande upptäckter som har förbättrat vår förståelse av fysiologi av gramnegativa bakterier, mekanismer för antibiotika motstånddelse, den humana medfödda immunsvar, och har gett många nya mål för utvecklingen av antibakteriella föreningar.

Canonical lipid A från E. coli och Salmonella enterica serovar Typhimurium är en hexa-acylerad disackarid av glukosamin med fosfatgrupper vid 1 - och 4 &quot;-positionerna. Under tillväxt i rika medier (t.ex. Luria Broth) ett parti av den lipid A innehåller en pyrofosfatgrupp vid 1-ställningen i utbyte ge en Tris-fosforylerade art 36 (figur 1). Kdo (3-deoxi-D-manno-octulosonic syra), är fäst vid 6&#39;-hydroxylgruppen och tjänar som en bryg...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria at JoVE.com

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolering och karakterisering av lipid A-domänen av lipopolysackarid (LPS) från gramnegativa bakterier ger en inblick i cellytan baserade mekanismer för antibiotikaresistens, bakteriell överlevnad och fitness, och hur kemiskt varierande lipid A molekylslag modulera differentiellt värd medfödda immunsvar.

Isolering och kemisk karakterisering av lipid A från gramnegativa bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Fria radikaler i kemisk biologi: från Chemical beteende till biomarkörer utveckling

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Vikning och karakterisering av en Bio-lyhörd robot från DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nukleosidtrifosfaterna - Genom syntes till Biochemical karakterisering

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

En Inverse Analys Närma till karakterisering av kemiska Transport i Färger

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntes och karakterisering av funktionaliserad metal-organic frame

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Förbereda Vidhäftande Cells för röntgen fluorescens avbildning av Chemical Fixering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntes och karakterisering av Supramolekylära Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Beredning och utvärdering av<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-märkt tridentat Chelates för Pre-inriktning Använda Bioorthogonal kemi

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Mikroflödessystem torr-spinning och karakterisering av regenererad Silk Fibroin fibrer

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

En konstruerad Split-TET2 enzym för kemisk-inducerbara DNA Hydroxymethylation och epigenetiska Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...