Name: establishment of an in vitro system to study intracellular behavior of candida glabrata in human thp-1 macrophages
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages at JoVE.com

この作品は、DNAフィンガープリントおよび診断のためのバイオテクノロジー本部、インド政府とセンターのコア·ファンドからの革新的な若手生物工学研究者賞BT/BI/12/040/2005とBT/PR13289/BRB/10/745/2009助成金によって支えられて、ハイデラバード。 MNR GBはマニパル大学の博士号の学位を追求に向けた科学産業研究評議会のジュニアとシニアリサーチフェローの受信者です。 SBはマニパル大学の博士号の学位を追求に向けたバイオテクノロジー本部のジュニアとシニアリサーチフェローシップ受賞。

これは、Cを実行することをお勧めしますバイオセーフティ封じ込めレベル2（BSL-2）との実験室でグラブラタ感染実験。 <ol><li> THP-1マクロファージ単層の調製。 </li><li> Cの準備グラブラタ細胞懸濁液。 </li><li> CとTHP-1マクロファージの感染グラブラタ細胞。 </li><li>コロニー形成単位アッセイによって貪食率および細胞内複製を測定する。 </li><li>共焦?...

<ol>
	<li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Invasive+Candidiasis:+a+Persistent+Public+Health+Problem.">Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem.</a> Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).</li><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+from+the+ARTEMIS+DISK+global+antifungal+surveillance+study.">Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).</li><li>Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. 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Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).</li><li>Murayama, T., Ohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cytomegalovirus+induces+Interleukin-8+production+by+a+human+monocytic+cell+line,+THP-1,+through+acting+concurrently+on+AP-1-+and+NF-kB-binding+sites+of+the+Interleukin-8+gene.">Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene.</a> J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).</li><li>Gross, O., Poeck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+kinase+signalling+couples+to+the+Nlrp3+inflammasome+for+anti-fungal+host+defence.">Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence.</a> Nature. 459, 433-436 (2009).</li><li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+leukemia+cell+line,+THP-1:+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation.">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li><li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester.">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li><li>Casta&#241;o, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata.">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li></ol>

自然免疫系は、日和見真菌感染症の制御に重要な役割を果たしている。マクロファージは、摂取および真菌病原体の破壊によって防衛を抗真菌に貢献。このように、生存および/またはマクロファージの抗菌機能に対抗するために必要な要因の解明は、真菌の病原性戦略の我々の理解を進める。この文脈において、我々は、ヒトの日和見真菌病原C.の相互作用を特徴づけるために、ヒト?...

カンジダ種は、免疫不全患者の生命を脅かす侵襲性真菌感染症の1の主要な原因である。 カンジダ·グラブラタ 、新興院内病原体は、地理的な位置1-3に応じて、集中治療室の患者からの第二または第三の最も頻繁に孤立したカンジダ種である。系統発生的に、C.グラブラタ 、半数体出芽酵母、より密接に病原性カンジダ属に比べcerevisiaeの非病原性のモデル酵母サッカロミセスに関連しています。Cを含むカンス 4。これと一致して、C.グラブラタ交配 、分泌されたタンパク質分解活性及び形態学的可塑性4-5を含むいくつかの重要な真菌の病原性の特徴を欠いている。 C.もののグラブラタが菌糸を形成しない、それが生き残るためには、6〜8は、それが独特の病因メカニズムを開発したことを示唆しているマウスおよびヒトのマクロファージ内で複製することができます。限られた情報は、C.戦略について提供されていますグラブラタは、栄養の乏しい細胞内マクロファージ環境を生き残るためには、酸化および5宿主免疫細胞によって取り付けられた非酸化宿主応答に対抗するために採用しています。関連マクロファージモデル系は、Cの相互作用を描写する前提条件である機能的ゲノムおよびプロテオミクスのアプローチを介してホスト貪食細胞とグラブラタ 。末梢血単核細胞（PBMC）及びヒトおよびマウス由来の骨髄由来マクロファージ（BMDMs）は、それぞれ、以前のC.の相互作用を研究するために使用されている宿主免疫細胞7,9とグラブラタ 。しかし、PBMCおよびBMDMsを得ることが困難、その限られた寿命と異なる哺乳動物ドナー間本質的な変化は、これらの細胞の活用など多彩なモデルシステムを制限します。 ここでは、intracellulを研究するためのin vitro系の確立のための方法を説明しますCの ARの挙動ヒト単球細胞株THP-1由来マクロファージにおける細胞グラブラタ 。このプロトコルの全体的な目標は、簡単にホスト真菌病原体の相互作用の様々な側面を研究するために操作することができる、簡単で、安価、迅速、かつ再現性の細胞培養モデル系を制定することでした。 THP-1細胞は、以前は、細菌、ウイルス、および真菌10-12を含む広範囲の病原体に対する宿主免疫応答を解読するために使用されている。単球THP-1細胞を維持するのに容易であり、ヒトの単球由来のマクロファージを模倣し、適切なマクロファージマーカー13を発現するマクロファージ、ホルボールエステル治療の際に、区別することができる。 THP-1マクロファージモデル系の主な利点は、使いやすさと洗練された機器の必要がないことである。 ここで紹介するプロトコルは、HOSで、他の人間の真菌病原体の相互作用を研究する容易に適応される免疫細胞をトン。現在の手順はまた、ハイスループット変異スクリーニングを使用して、関心対象の病原体の病原性因子を同定するために用いることができる。この概念実証は、ヒトマクロファージ8にC.グラブラタの生存のために必要とされる56遺伝子のセットを同定するために、THP-1培養モデルシステムの使用の成功により例示した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:40px;width:163px;">THP-1</td>
			<td style="width:105px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:85px;">TIB 202</td>
			<td style="width:243px;">Human acute monocytic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:105px;">Hyclone</td>
			<td style="width:85px;">SH30096.01</td>
			<td style="width:243px;">For maintaining THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">P 8139</td>
			<td style="width:243px;">Caution: Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">YPD&#160;</td>
			<td style="width:105px;">BD-Difco</td>
			<td style="width:85px;">242710</td>
			<td style="width:243px;">For growing Candida glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">F8775</td>
			<td style="width:243px;">For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,&#160; pH 7.4) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Saline-sodium citrate (SSC)&#160;</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Prehybridization buffer</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (50% formamide, 5x Denhardt&#8217;s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">VECTASHIELD mounting medium</td>
			<td style="width:105px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:85px;">H-1200</td>
			<td style="width:243px;">For mounting slides for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">32P-labeled &#945;-dCTP</td>
			<td style="width:105px;">JONAKI-BARC</td>
			<td style="width:85px;">LCP-102</td>
			<td style="width:243px;">For radiolabeling of signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">100 mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">430167</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">24-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">3527</td>
			<td style="width:243px;">To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">4-chamber tissue culture-treated glass slide</td>
			<td style="width:105px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:85px;">REF354104</td>
			<td style="width:243px;">To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:105px;">Rohem India</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">For enumeration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Table top microcentrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:85px;">Microfuge 18</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in microtubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Table top centrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Remi</td>
			<td style="width:85px;">R-8C</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in 15 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:85px;">Ultraspec 10</td>
			<td style="width:243px;">To monitor absorbance of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Plate incubator</td>
			<td style="width:105px;">Labtech</td>
			<td style="width:85px;">Refrigerated</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:85px;">Innova 43</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Water jacketed CO2&#160; incubator</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Electron Corporation</td>
			<td style="width:85px;">Forma series 2</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:105px;">Carl Ziess</td>
			<td style="width:85px;">Ziess LSM 510 meta&#160;</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:85px;">CKX 41</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata and THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">PCR machine</td>
			<td style="width:105px;">BioRad&#160;</td>
			<td style="width:85px;">DNA Engine</td>
			<td style="width:243px;">To amplify unique tags from input and output genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:105px;">Labnet</td>
			<td style="width:85px;">Problot 12S</td>
			<td style="width:243px;">For hybridization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PhosphorImager</td>
			<td style="width:105px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:85px;">FLA-9000</td>
			<td style="width:243px;">For scanning hybridized membranes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:85px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:243px;">For denaturation of radiolabeled signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:163px;">Gel documentation unit</td>
			<td style="width:105px;">Alphainnontech</td>
			<td style="width:85px;">Alphaimager</td>
			<td style="width:243px;">To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an in vitro system to study intracellular behavior of candida glabrata in human thp-1 macrophages

細胞培養モデル系では、ホスト環境条件の近隣模倣場合、微生物病原体感染の特定の段階の研究のための動物モデル系を、安価で再現性があり、容易に操作可能な代替物として機能することができる。 、ホルボールエステル治療の際に、マクロファージに分化されたTHP-1ヒト単球細胞株は、以前に結核菌を含む多くの細胞内病原体の病原性戦略を研究するために使用されている。ここでは、in vitro細胞培養モデルを制定するためのプロトコルを議論ホスト貪食細胞と日和見人間酵母病原体のカンジダ·グラブラタの相互作用を記述するために、THP-1マクロファージを用いたシステム。このモデル系は、簡単、迅速、ハイスループット変異スクリーニングに適しており、まだ高度な機器を必要としない。典型的なTHP-1マクロファージ感染実験を回収し、細胞内を可能にするために、追加の24〜48時間で約24時間を要するコロニー形成単位ベースの実行可能性の分析のための富栄養培地上で増殖する酵母。他のin vitroモデル系と同様に、このアプローチの可能な限界は、ヒト宿主に存在する非常に複雑な免疫細胞回路に得られた結果を外挿することが困難なことである。しかし、これにもかかわらず、現在のプロトコルは、真菌病原体が、抗菌応答に対抗して生き残る/回避適応し、宿主免疫細胞の貧栄養環境下で増殖するように使用することができる戦略を解明することは非常に便利です。

CとPMA処理したTHP-1マクロファージの感染分析グラブラタ野生型（wt）細胞は、wt細胞を、2時間の同時インキュベーション後に55〜65％の割合でマクロファージによって貪食されたことを明らかにした。さらに、C.グラブラタ細胞は、THP-1マクロファージによる殺傷に抵抗することができましたし、中程度の5を受けた- THP-1マクロファージ8と共培養の24時?...

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Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

現在の記事は、真菌の病原性のメカニズムの知識を進めるために有用なツールとなり、人間のマクロファージとの通性細胞内のヒトの真菌病原体のカンジダ·グラブラタの相互作用を研究するためのin vitroでの細胞培養モデル系を確立するためのプロトコルの概要を説明します。

設立<em&gt;インビトロ</em&gt;システムの細胞内挙動を研究するために、<em&gt;カンジダ·グラブラタ</em&gt;人間のTHP-1マクロファージにおける

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

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ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

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Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...