Name: a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system
Uploaded: 2013-10-18T18:30:00
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Wir möchten Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi und Sonia Garcia für wertvolle Erfahrungsberichte zu Verbesserungen für die Patch-Clamp-Verfahren Automatisierung danken. Wir danken Rajnish Ranjan für wertvolle Ratschläge und Unterstützung bei der Software-Implementierung. Diese Arbeit wurde zum Teil von der EU-Synapse-Projekt und teilweise von der Human Frontiers Science Program gefördert.

1. Vorbereitung der Ausrüstung <ol><li> Steuer Manipulatoren von einem Computer <ol><li> Schließen Sie jedes Mikromanipulator Controller-Box an einen Computer über serielle Schnittstellen (RS-232). </li><li> Implementieren Sie die Befehle für die Positionierung, Abfrage und die Einstellungen vornehmen, um über die serielle Schnittstelle gesendet werden. Angesichts Geschwindigkeit und Hardware-Kompatibilitätsprobleme C / C + + als Programmiersprache empfohlen. </li><li> Standardisieren Sie das Be...

<ol>
	<li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups.">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network.">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).</li><li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex.">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li><li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense,+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons:+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition.">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li><li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network:+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex.">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons.">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li><li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2.">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li><li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks.">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

Eine unmittelbare Frage stellt sich in der Regel über die Erfolgsquote des Verfahrens, die wir beschrieben. Für hohe Erfolgsraten Vorbereitung ist unerlässlich. Pipetten müssen Spitzenöffnungen, die ausreichend für den aufgenommenen Zellen Wesen sind. Filtern des intrazellulären Lösung verstopfte Pipette zu vermeiden, ist ebenfalls wichtig. Extrem sauber, frisch gezapftes Pipetten sind eine weitere Voraussetzung. Eine Binomialverteilung ist das einfachste Modell, die verwendet werden können, um zu verstehen, wi...

Die Fähigkeit, mehrere Seiten mit Mikrometer-Präzision aufnehmen und zu stimulieren ist sehr nützlich für experimentell ein besseres Verständnis der neuronalen Systemen. Viele Techniken haben zu diesem Zweck entwickelt worden, aber die submillivolt Beschluss der Patch-Clamp-Technik, die für das Studium unterschwellige Aktivität und einzelnen postsynaptischen Potentiale erreicht keiner erlauben. Hier behandeln wir die Entwicklung eines Zwölf-Elektrode computergestützten Patch-Clamp-System bei gleichzeitiger Aufnahme und Förderung einer großen Anzahl von Einzelzellen mit ausreichender Genauigkeit für die Untersuchung der neuronalen Konnektivität gerichtet. Während viele andere Anwendungen für ein solches System konzipiert werden, eignet es sich besonders gut für die Untersuchung von synaptischer Verbindungen gegeben, dass die Anzahl der möglichen Verbindungen innerhalb einer Gruppe von Neuronen wächst proportional zu dem Quadrat der Anzahl von Neuronen in Frage. Während also ein System mit drei Elektroden ermöglicht die Prüfung derAuftreten von bis zu sechs Verbindungen und meist Aufnahme eines einzigen, Aufzeichnungs zwölf Neuronen ermöglicht das Testen des Auftretens von bis zu 132 Anschlüsse, und oft mehr als ein Dutzend beobachtet (Abbildung 1). Die Beobachtung von Dutzenden von Verbindungen gleichzeitig ist es möglich, die Organisation von kleinen Netzwerken zu analysieren und zu schließen statistische Eigenschaften der Netzwerkstruktur, die nicht anderweitig 1 untersucht werden können. Darüber hinaus ermöglicht eine präzise Stimulation von zahlreichen Zellen auch die Quantifizierung der Rekrutierung von postsynaptischen Zellen 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td>Serial protocol used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>VS 55</td>
			<td>BNC analog output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framegrabber</td>
			<td>Data Translation</td>
			<td>DT3120</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS 2014</td>
			<td>Serial communication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>InstruTECH</td>
			<td>ITC 1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Library used (.dll)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure valve</td>
			<td>SMC</td>
			<td>SMC070C-6BG-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24PCDFA6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane pump</td>
			<td>Schego</td>
			<td>Optimal</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

Die Patch-Clamp-Technik ist heute die etablierten Verfahren zur Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von einzelnen Neuronen, Zellen oder Zell Fächern. Dennoch Erreichen eines stabilen Aufnahmen, auch aus einzelnen Zellen, bleibt ein zeitaufwendiges Verfahren von beträchtlicher Komplexität. Automatisierung von vielen Schritten in Verbindung mit effizienter Informationsanzeige kann sehr helfen Experimentatoren bei der Durchführung einer größeren Anzahl von Aufnahmen mit größerer Zuverlässigkeit und in weniger Zeit. Um großflächige Aufnahmen zu erreichen schlossen wir der effizienteste Ansatz ist nicht vollständig zu automatisieren den Prozess, sondern um die experimentellen Schritte zu vereinfachen und reduzieren die Chancen auf menschliche Fehler während effizient Erfahrung des Experimentators und visuelles Feedback Einbeziehung. Mit diesen Zielen vor Augen haben wir ein computergestütztes System, das alle notwendigen Kontrollen für eine Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Experiment in einer einzigen Schnittstelle, einem commerc zentralisiert entwickeltmathematisch verfügbaren Wireless-Gamepad, während der Anzeige Experiment bezogene Informationen und Führungssignale auf dem Computer-Bildschirm. Hier beschreiben wir die verschiedenen Komponenten des Systems, die uns die Zeit zum Erreichen der Aufnahmekonfiguration zu reduzieren und die Chancen für die erfolgreiche Aufnahme einer großen Anzahl von Nervenzellen gleichzeitig zu erhöhen erlaubt.

Nach den oben beschriebenen Verfahren ist es gelungen, gleichzeitig ausführen Ganzzell-Aufzeichnung von bis zu zwölf Neuronen nahezu verdoppelt die größte Anzahl von Neuronen gleichzeitig patch-geklemmt so weit. Beispiele für Netzwerke der direkten synaptischen Verbindungen zwischen den pyramidalen Neuronen in Schicht V im somatosensorischen Cortex von Ratten sind in Abbildung 6 gezeigt. Die Bestimmung der Verbindungswahrscheinlichkeit Profile als eine Funktion der Zwis...

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A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufnahmen bilden eine komplexe Aufgabe. Hier zeigen wir, wie durch die Automatisierung vieler Versuchsschritten ist es möglich, den Prozess zur qualitativen Verbesserung der Leistung und der Anzahl der Aufnahmen zu beschleunigen.

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Vorbereitung und Technik für Darstellende Patch-Clamp-Recordings von submitochondrialen Vesikelmembranen

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...