Name: a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system
Uploaded: 2013-10-18T18:30:00
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Vorremmo ringraziare Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, e Sonia Garcia per preziosi consigli sul miglioramento della procedura di automazione patch-clamp. Ringraziamo Rajnish Ranjan per la consulenza e l&#39;assistenza con l&#39;implementazione software di valore. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal progetto Synapse UE e in parte dal Programma di Scienza Human Frontiers.

1. Preparazione del materiale <ol><li> Manipolatori di comando da un computer <ol><li> Collegare ogni casella di controllo micromanipolatore ad un computer tramite porte seriali (RS-232). </li><li> Implementare i comandi per il posizionamento, l&#39;interrogazione e la regolazione delle impostazioni da inviare tramite la porta seriale. Problemi di velocità e compatibilità hardware fornite C / C + + è raccomandato come linguaggio di programmazione. </li><li> Standardizzare il sistema di riferimento ...

<ol>
	<li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups.">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network.">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).</li><li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex.">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li><li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense,+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons:+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition.">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li><li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network:+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex.">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons.">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li><li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2.">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li><li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks.">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

Una domanda immediata di solito si pone per quanto riguarda il tasso di successo della procedura che abbiamo descritto. Per le alte percentuali di successo preparazione è essenziale. Le pipette devono avere aperture di punta che sono adeguati per le cellule degli esseri registrati. Filtrare la soluzione intracellulare per evitare pipette ostruiti è anche importante. Estremamente pulite, pipette appena tirato sono un altro requisito. Una distribuzione binomiale è il modello più semplice che può essere utilizzato per...

La capacità di registrare e stimolare diversi siti con precisione micrometrica è estremamente utile per sperimentalmente conseguire una migliore comprensione dei sistemi neuronali. Molte tecniche sono stati sviluppati per questo scopo ma nessuno consentire la risoluzione submillivolt realizzato con la tecnica patch-clamp, essenziale per lo studio dell&#39;attività sottosoglia e singoli potenziali postsinaptici. Qui copriamo lo sviluppo di un sistema di patch-clamp dodici elettrodi assistita da computer volto a registrare simultaneamente e stimolare un gran numero di singole cellule con precisione sufficiente per lo studio della connettività neuronale. Mentre molte altre applicazioni possono essere concepite per un tale sistema, si presta particolarmente bene allo studio della connettività sinaptica dato che il numero di possibili connessioni all&#39;interno di un gruppo di neuroni cresce proporzionalmente al quadrato del numero di neuroni in questione. Pertanto, mentre un sistema a tre elettrodi consente di testare l&#39;verificarsi di fino a sei connessioni e più spesso registrando una sola, registrazione dodici neuroni consente di testare la presenza di fino a 132 connessioni e frequentemente osservando oltre un dozzina (Figura 1). L&#39;osservazione di decine di connessioni contemporaneamente rende possibile analizzare l&#39;organizzazione delle piccole reti e dedurre le proprietà statistiche della struttura di rete che non può essere sondato altrimenti 1. Inoltre, la stimolazione precisa di numerose cellule permette anche la quantificazione del reclutamento di cellule postsinaptici 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td>Serial protocol used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>VS 55</td>
			<td>BNC analog output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framegrabber</td>
			<td>Data Translation</td>
			<td>DT3120</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS 2014</td>
			<td>Serial communication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>InstruTECH</td>
			<td>ITC 1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Library used (.dll)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure valve</td>
			<td>SMC</td>
			<td>SMC070C-6BG-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24PCDFA6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane pump</td>
			<td>Schego</td>
			<td>Optimal</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

La tecnica del patch-clamp è oggi il metodo più consolidata per la registrazione dell&#39;attività elettrica di singoli neuroni o dai loro compartimenti subcellulari. Tuttavia, ottenere registrazioni stabili anche da cellule singole, rimane un tempo procedura di notevole complessità. Automazione di molti passi in congiunzione con display informativo efficiente potranno agevolare sperimentali in esecuzione di un numero maggiore di registrazioni con una maggiore affidabilità e in meno tempo. Per conseguire registrazioni su larga scala abbiamo concluso l&#39;approccio più efficiente non è di automatizzare completamente il processo ma per semplificare le fasi sperimentali e ridurre le possibilità di errore umano mentre efficientemente incorporando esperienza dello sperimentatore e feedback visivo. Con questi obiettivi in ​​mente, abbiamo sviluppato un sistema computerizzato che centralizza tutti i controlli necessari per un esperimento di patch-clamp multi-elettrodo in una singola interfaccia, un commercbuona resa disponibile gamepad wireless, mentre la visualizzazione esperimento correlate di informazione e orientamento spunti sullo schermo del computer. Qui si descrivono le diverse componenti del sistema che ci ha permesso di ridurre il tempo necessario per raggiungere la configurazione di registrazione e sostanzialmente aumentare le possibilità di successo registrando un gran numero di neuroni contemporaneamente.

Seguendo i metodi descritti sopra siamo riusciti a eseguire la registrazione a cellula intera fino a dodici neuroni simultaneamente, quasi raddoppiando il maggior numero di neuroni simultaneamente patch-bloccato finora. Esempi di reti di connessioni sinaptiche diretti tra piramidale neuroni registrati in strato V della corteccia somatosensoriale di ratti sono mostrati in Figura 6. La determinazione dei profili di probabilità connessione in funzione della distanza inter-soma...

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A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

Multi-elettrodo patch-clamp costituiscono un compito complesso. Qui vi mostriamo come, per l&#39;automazione di molti dei passaggi sperimentali, è possibile accelerare il processo che porta al miglioramento qualitativo delle prestazioni e il numero di registrazioni.

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...