Name: ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells
Uploaded: 2013-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af priser fra HHMI 56006760 til JDV, National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24.158-6) til DMAW og fra Ellison Medical Foundation (AG-SS-2465) og NIH (GM45735, GM45735S1 og GM096445) til LP. GM45735S1 blev udstedt fra NIH under den amerikanske Nyttiggørelse og Reinvestering Act of 2009. De mikroskoper anvendes til disse undersøgelser blev støttet delvist via en NIH / NCI tilskud (5 P30 CA13696).

1.. Transformation af gær celler med biosensorer <ol><li> Omdan den ønskede gærstamme med plasmid bærende Mito-roGFP eller mitGO-ATeam2 bruge lithiumacetatfremgangsmåden 27. </li><li> For at bekræfte transformation med den plasmidbåret biosensor og for at forhindre tab af plasmidet, vælge og vedligeholde transformanter på passende selektivt syntetisk komplet medium (SC-Ura Mito-roGFP eller SC-Leu til mitGo-ATeam2). Hvis den fluorescerende probe er blevet subklonet i en anden plasmid end de her besk...

<ol>
	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

Her beskriver vi metoder til at bruge Mito-roGFP1 og mitGO-ATeam2 som biosensorer til at vurdere mitokondrie redoxtrin og ATP niveauer i levende gærceller. Vi finder, at ekspressionen af plasmidbårne Mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam resulterer i kvantitative mål for mitokondrier, uden nogen indlysende effekt på mitokondrie morfologi eller distributionen eller på cellulære vækstrater. 3 Mito-roGFP1 kan registrere ændringer i mitokondrie redoxtilstanden fra højt oxideret til stærkt reducerede tilstande. ...

Mitokondrier er væsentlige organeller til ATP-produktion, biosyntese af aminosyrer, fedtsyrer, heme, jern svovl klynger og pyrimidiner. Mitokondrier også spille afgørende roller i calciumhomeostase, og regulering af apoptose. 1 stigende tegn links mitokondrier til aldring og aldersrelaterede sygdomme, herunder Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, amyotrofisk lateral sklerose og Huntingtons sygdom. 2. Mens personer lever hele deres liv med mutationer i mitokondrielle proteiner, der er forbundet med neurodegenerative sygdomme, sygdomssymptomerne kun forekommer senere i livet. Dette indikerer, at der sker ændringer i mitokondrier med alderen, der tillader sygdom patologi at dukke op. Faktisk er mitokondrie fitness korreleret med generelle celle sundhed og levetid i gær-og pattedyrceller. 3,4 Her beskriver vi, hvordan du bruger genetisk kodede Ratiometrisk fluorescerende biosensorer til at vurdere to kritiske funktioner i mitochondria i levende gærceller: redoxtrin og ATP niveauer. Mitokondriefunktionen i aerob energi mobilisering er veletableret. Mitokondrie redoxtrin er et produkt af reducerende og oxiderende arter i organel, herunder NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutathion / glutathiondisulfid (GSH / GSSG) og reaktive oxygenarter (ROS). Afkobling mitokondrier eller hypoxi påvirker mitokondrie respiratoriske aktivitet og ændrer forholdet mellem NAD + til NADH i organel. ROS, som er fremstillet af ineffektive elektronoverførsel mellem komplekser af elektron transportkæden i den indre mitokondrielle membran, samt fra deaminering af aminer via monoaminoxidase i den ydre mitokondriemembran 5, skader lipider, proteiner og nukleinsyrer og har været knyttet til aldring og alder-associerede neurodegenerative sygdomme 6,7,8. ROS også spille en rolle i signaltransduktion i mitochondria gennem oxidation af GSH. For eksempel, ikke kun NADH dehydrogenase bidrager til ROS produktion, men også er reguleret gennem interaktioner med glutathion pool 9,10. α-ketoglutarat dehydrogenase og aconitase, komponenter af TCA cyklus udviser nedsat aktivitet i oxiderende miljøer 11,12. Faktisk er redox-afhængig regulering af aconitase aktivitet bevaret fra bakterier til pattedyr 13,14. Således overvågning redoxtilstanden og ATP niveauer af mitokondrier er afgørende for at forstå deres funktion og rolle i sygdom patologi. Biokemiske metoder er blevet anvendt til at vurdere redoxtrin eller ATP niveauer af hele celler eller isolerede mitokondrier. Udbredte metoder til at vurdere redox tilstand af hele celler eller isolerede mitokondrier, er baseret på måle niveauet af redox parret GSH / GSSG 15.. Luciferin-luciferase-systemet er almindeligt anvendt til at måle mitokondrieATP i enten permeabiliserede hele celler eller isolerede mitokondrier. 16,17,18,19,20 i dette assay, luciferase binder til ATP og katalyserer oxidationen af og kemiluminiscens fra luciferin. 21. Intensiteten af det udsendte lys er proportional med mængden af ATP i reaktionsblandingen. 22. Disse metoder har afsløret grundlæggende oplysninger om mitokondrie funktion, herunder den konstatering, at patienter med neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom, har unormalt lave ATP-niveauer. 23. De kan dog ikke bruges til at afbilde levende, intakte celler. Desuden metoder baseret på helcelle-analyse giver et gennemsnit af redoxtrin eller ATP i alle rum i cellen. Målinger i isolerede organeller er potentielt problematiske, fordi mitokondrie redoxtrin eller ATP niveauer kan ændre sig i løbet subcellulær fraktionering. Endelig seneste undersøgelser fra vores laboratorium, og andre viser, atmitokondrier i de enkelte celler er heterogene i funktion, hvilket igen påvirker levetiden for mor og datter celler. 3. Der er således et behov for at måle mitochondrielle ATP niveauer og redoxtilstanden i levende celler med subcellulær opløsning. De biosensorer til mitokondriefunktionen beskrevet her, er begge baseret på GFP. Redox-følsomme GFP (roGFP) 24,25 er en GFP variant, hvor overfladeeksponerede cysteiner tilsættes til molekylet. roGFP, ligesom vildtype-GFP, har to excitation toppe (ved ~ 400 nm og ~ 480 nm) og en emission topper ved ~ 510 nm. Oxidation af cysteinresterne i roGFP resulterer i en stigning i excitation ved ~ 400 nm. Reduktion af disse cysteiner favoriserer excitation ved ~ 480 nm. Således er forholdet mellem 510 nm emission ved excitation af roGFP ved 480 nm og 400 nm afslører den relative mængde af reduceret og oxideret roGFP, hvilket afspejler redoxtilstanden af ​​fluoroforen miljø. To versioner af roGFP er meget udbredt: roGFP1 og roGFP2. Begge indeholder de samme cystein indrykninger. roGFP1 er baseret på vildtype-GFP og roGFP2 er baseret på S65T-GFP, som har en mere effektiv excitation ved 480 nm og mindre effektiv excitation ved 400 nm i forhold til wtGFP 24.. roGFP1 er mindre pH følsom end roGFP2 og dens dynamikområde rækker længere ud i reducerede rækkevidde. Således kan roGFP1 være mere nyttigt for at overvåge mere reducerende rum såsom mitokondrier eller cytosolen, og segmenter med en variabel pH, såsom endosomer. roGFP2 tilbyder lysere signal og, i nogle undersøgelser, en større dynamikområde end roGFP1 24,26. Studier i Arabidopsis thaliana indikerer, at den tid, der kræves for reaktion på ændringer i redoxtilstand er ens for begge sensorer (t ½ til oxidation, 65 og 95 sek og t ½ for reduktion, 272 og 206 sek, for roGFP1 og roGFP2, henholdsvis). 26. MitGO-ATeam2 er en minimalt invasiv, pålideligsensor, der måler mitokondrie ATP i den spirende gæren Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam er en Förster resonans energi overførsel (FRET) sonde, der består af ε-underenheden af F o F 1-ATP syntase klemt mellem FRET donor og acceptor fluorescerende proteiner (GFP og orange fluorescerende protein (OFP), henholdsvis). 27. binding af ATP til ε subunit resulterer i konformationelle ændringer i proteinet, der bringer FRET donor i tæt nærhed til acceptoren og tillade energioverførsel fra donor til acceptor. Der er to varianter af GO-ATeam, GO-ATeam1 og GO-ATeam2. GO-ATeam2 har en højere affinitet for MgATP end GO-ATeam1, hvilket gør det mere egnet til at måle den typisk lavere [ATP] i mitokondrierne i forhold til cytosolen. 27. Til at sondere mitokondrie redoxtrin konstruerede vi et fusionsprotein (Mito-roGFP1) bestående af roGFP1 fusioneret til ATP9 ledersekvensen ennd udtrykt fra en centromer-baseret (lavt kopiantal) gærekspressionsplasmid under styring af den stærke glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Vi brugte roGFP1 til at undersøge redox status mitokondrier i forbindelse med aldring af modellen svampen Saccharomyces cerevisiae. Vi finder, at roGFP1 kan påvise ændringer i mitokondrie redoxtrin der opstår under ældning og som reaktion på tilgængeligheden af ​​næringsstoffer, men har ingen tilsyneladende skadelig virkning på gærceller. Vi ser også variabilitet i redox tilstand af mitokondrier i individuelle levende gærceller, en konstatering, der understreger vigtigheden af ​​en biosensor med subcellulær rumlig opløsning. MitGO-ATeam2 er en variant af GO-ATeam2, som har mitokondrie signalsekvensen af cytochrom c-oxidase-underenhed VIII indsat ved aminoterminalen af GO-ATeam2. 27. Vi modificerede mitGO-ATeam2 sonde (venligst tilvejebragt af laboratoriet H. Noji, Institut of videnskabelig og industriel forskning, Osaka University, Japan) til brug i gær ved subkloning det via Xba1 og HindIII-steder, ind i gærekspressionsvektoren pAG415GPD-CCDB (Addgene, Cambridge, MA, USA), hvilket er en lav-kopi plasmid indeholdende den stærke konstitutive GPD-promotor. Vi udtrykte mitGO-ATeam2 i spirende gær, og finde, ved modfarvning DNA-bindende farvestof DAPI, at det lokaliserer udelukkende for mitokondrier, hvor det fungerer som en effektiv probe til måling af fysiologiske ændringer i mitokondrie ATP niveauer. roGFP og GO-ATeam begge genetisk kodet. Som et resultat, kan de blive introduceret og stabilt opretholdt i intakte celler, og giver oplysninger om redox stat eller ATP i individuelle, levende celler. Desuden har begge biosensorer overvåge ændringer i redox stat eller ATP niveauer, der opstår under fysiologiske betingelser. 28. Begge sonder er også ratiometriske. Som et resultat, er målinger foretaget med disse prober ikke påvirket af changes i biosensor koncentration eller prøve belysning eller tykkelse. Endelig er begge biosensorer giver subcellulært rumlig opløsning. Faktisk har roGFP været målrettet til mitokondrier, ER, endosomer og peroxisomer 24, og kan påvise ændringer i redoxtilstand af hver af disse organeller, stort set uafhængig af pH.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

Mitokondrier har roller i mange cellulære processer, fra energi metabolisme og calcium homeostase at styre af cellulær levetid og programmeret celledød. Disse processer påvirker og påvirkes af redox status og ATP produktion af mitokondrier. Her beskriver vi brugen af ​​to ratiometrisk, genetisk indkodede biosensorer, der kan opdage mitokondrie redoxtrin og ATP niveauer subcellulære opløsning i levende gærceller. Mitokondrie redoxtrin måles ved hjælp af redox-følsomme grønt fluorescerende protein (roGFP), der er målrettet til det mitokondrielle matrix. Mito-roGFP indeholder cysteiner i positionerne 147 og 204 af GFP, der undergår reversibel og miljø-afhængig oxidation og reduktion, hvilket igen ændrer ekscitationsspektret af proteinet. MitGO-ATeam er en Förster resonans energi overførsel (FRET) sonde, hvor ε underenheden af F o F 1-ATP syntase mellemlæg FRET donor og acceptor fluorescent proteiner. Binding af ATP til ε subunit resulterer i kropsbygning ændringer i proteinet, der bringer FRET donor og acceptor i tæt nærhed og muliggøre fluorescensresonansenergioverførsel fra donor til acceptor.

Måling mitokondrie redox tilstand med Mito-roGFP Her viser vi, at Mito-roGFP1 har det dynamiske område at konstatere ændringer i mitokondrie redoxtilstanden fra fuldstændigt oxideret til reduceret i levende gærceller, uden at det påvirker gærcellevækst eller mitokondrie morfologi. Først finder vi celler, der udtrykker mitokondrier målrettet GFP og roGFP1 vokse med normale satser (figur 1A). Den maksimale vækstrate, som målt ved maksimal hældning på vækstkurven un...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Vi beskriver anvendelsen af ​​to ratiometrisk, genetisk indkodede biosensorer, som er baseret på GFP, til at overvåge mitokondrie redoxtrin og ATP niveauer subcellulære opløsning i levende gærceller.

Ratiometrisk Biosensors, der måler Mitochondrial Redox stat og ATP i Living Gærcellers

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Fluorescenslevetiden Imaging for Molekylær Rotorer i levende celler

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Spatio-tidsmæssige Manipulation af Lille GTPase aktivitet på Subcellulær niveau og på Tidsplan for Seconds i levende celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Hollow mikro-baserede sensor for Multiplexed Transdermal Elektrokemisk Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Måling af mekaniske egenskaber af levende celler bruge Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optisk påvisning af<em&gt; E. coli</em&gt; bakterier ved Mesoporøse Silicon biosensorer

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Isolering af Cellular lipiddråber: To oprensningsteknikker start fra gærceller og menneskelige moderkager

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk kontrol af levende celler Elektrisk aktivitet ved Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

En protokol til brug af Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -Force Biosensorer at måle mekaniske kræfter på tværs af Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Brug Syntetisk Biologi Engineer levende celler der Grænseflade med Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...