Name: ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells
Uploaded: 2013-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por prêmios de HHMI 56006760 para JDV, o National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) para DMAW, e da Fundação Médica Ellison (AG-SS-2465) e do NIH (GM45735, GM45735S1 e GM096445) para LP. GM45735S1 foi emitido a partir do NIH sob a Recuperação Americana e Reinvestimento de 2009. Os microscópios utilizados para estes estudos foram apoiados, em parte, através de uma subvenção NIH / NCI (5 P30 CA13696).

1. Transformação de células de levedura com o Biossensores <ol><li> Transformar a estirpe de levedura com o plasmídeo desejado Mito-roGFP ou mitGO-ATeam2 usando o método do acetato de lítio 27. </li><li> Para confirmar a transformação com o plasmídeo de biossensor de origem e para evitar a perda do plasmídeo, seleccionar e manter os transformantes no meio completo sintético selectivo apropriado (SC-Ura para Mito-roGFP, ou SC-Leu por mitGo-ATeam2). Se a sonda fluorescente foi subclonado num plasm?...

<ol>
	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

Aqui, descrevemos métodos para usar mito-roGFP1 e mitGO-ATeam2 como biossensores para avaliar o estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em células de levedura viva. Nós achamos que a expressão de plasmídeo de origem mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam resulta em quantitativo direcionamento para mitocôndria, sem qualquer efeito óbvio sobre a morfologia e distribuição mitocondrial ou nas taxas de crescimento celular. 3 Mito-roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial de altamente oxidad...

As mitocôndrias são organelos essenciais para a produção de ATP, a biossíntese de aminoácidos, ácidos gordos, heme, aglomerados de enxofre do ferro e pirimidinas. As mitocôndrias também desempenham um papel fundamental na homeostase do cálcio e na regulação da apoptose. Uma crescente evidência de ligações mitocôndrias ao envelhecimento e doenças relacionadas à idade, incluindo a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica e doença de Huntington. 2 Enquanto as pessoas vivem suas vidas inteiras com mutações em proteínas mitocondriais que estão associadas a doenças neurodegenerativas, os sintomas da doença ocorrerem apenas mais tarde na vida. Isto indica que as mudanças ocorrem nas mitocôndrias com a idade, que permitem a patologia a emergir. De fato, aptidão mitocondrial está relacionada com a saúde geral e longevidade celular em leveduras e células de mamíferos 3,4 Aqui., Descrevemos como usar geneticamente codificados, biossensores fluorescentes raciométrica para avaliar dois aspectos críticos do mitochondria em células de levedura viva: o estado redox e os níveis de ATP. Função mitocondrial na mobilização de energia aeróbica está bem estabelecida. Estado redox mitocondrial é um produto da redução e espécies oxidantes na organela, inclusive NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutationa / glutationa oxidada (GSH / GSSG) e espécies reativas de oxigênio (ROS). Desacoplamento mitocondrial ou hipóxia afeta a atividade respiratória mitocondrial e altera a relação de NAD + para NADH na organela. ROS, que são produzidos a partir de transferência de electrões entre ineficiente complexos da cadeia de transporte de electrões na membrana mitocondrial interna, bem como a partir da desaminação de aminas através da monoamina oxidase na membrana mitocondrial externa 5, lípidos, proteínas, danos e ácidos nucleicos e têm foi associada ao envelhecimento e as doenças neurodegenerativas associadas à idade 6,7,8. ROS também desempenhar um papel na transdução de sinal em mitochondria, através da oxidação de GSH. Por exemplo, NADH desidrogenase não só contribui para a produção de ROS, mas também é regulada através de interações com o pool de glutationa 9,10. desidrogenase α-cetoglutarato e aconitase, componentes do ciclo do TCA, exibem uma actividade reduzida em ambientes oxidantes 11,12. Na verdade, a regulação redox dependente da atividade aconitase é conservada de bactérias a mamíferos 13,14. Assim, o monitoramento do estado redox e os níveis de ATP das mitocôndrias é crucial para entender sua função e papel na patologia da doença. Métodos bioquímicos têm sido usados ​​para avaliar o estado redox, ou os níveis de ATP de células inteiras ou mitocôndrias isoladas. Métodos amplamente utilizadas para avaliar o estado redox de células inteiras ou mitocôndrias isoladas são baseadas na medição dos níveis do par redox de GSH / GSSG 15. O sistema luciferina-luciferase é comumente usado para medir mitocondrialEm ambos os níveis de ATP de células inteiras permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. 16,17,18,19,20 Neste ensaio, liga-se a luciferase de ATP e catalisa a oxidação da luciferina e de quimioluminescência. 21 A intensidade da luz emitida é proporcional à quantidade de ATP na mistura reaccional 22. Estes métodos têm revelado informação fundamental em relação a função mitocondrial, incluindo a descoberta de que os pacientes com doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer, têm níveis anormalmente baixos de ATP 23. No entanto, eles não podem ser utilizados para a imagem de vida, as células intactas. Além disso, os métodos baseados na análise de célula completa fornecer uma média de estado redox, ou os níveis de ATP em todos os compartimentos da célula. Medidas em organelas isoladas são potencialmente problemático porque o estado redox mitocondrial ou níveis de ATP podem mudar durante o fracionamento subcelular. Finalmente, estudos recentes do nosso laboratório e outros indicam quemitocôndrias dentro das células individuais são heterogêneos em função, que por sua vez afeta a vida útil das células-mãe e filha. 3 Assim, há uma necessidade de medir os níveis de ATP mitocondrial e estado redox em células vivas com resolução subcelular. Os biossensores para a função mitocondrial descrita aqui são ambos baseados em boas práticas agrícolas. GFP Redox-sensível (roGFP) 24,25 é uma variante da GFP em que superfície expostas cisteínas são adicionados à molécula. roGFP, como a GFP do tipo selvagem, que apresenta dois picos de excitação (em ~ 400 nm e ~ 480 nm) e um pico de emissão a 510 nm ~. A oxidação dos resíduos de cisteína em roGFP resulta em um aumento na absorção a 400 nm, ~. Redução dos cisteínas favorece excitação a 480 nm, ~. Assim, a razão de emissão de 510 nm após excitação de roGFP em 480 nm e 400 nm, revela a quantidade relativa de roGFP reduzida e oxidada, o que reflecte o estado redox do meio ambiente do fluoróforo. Duas versiões de roGFP são amplamente utilizados: roGFP1 e roGFP2. Ambos contêm as mesmas inserções de cisteína. roGFP1 baseia-se na GFP do tipo selvagem e roGFP2 baseia-S65T GFP, que tem mais eficiente excitação a 480 nm e menos eficiente de excitação a 400 nm em comparação com wtGFP 24. roGFP1 é menos sensível do que o pH roGFP2 e a sua gama dinâmica estende ainda mais para o intervalo reduzido. Assim, roGFP1 pode ser mais útil para o monitoramento mais reduzindo compartimentos tais como mitocôndrias ou citosol, e compartimentos com pH variável, como endossomos. roGFP2 oferece sinal brilhante e, em alguns estudos, uma maior gama dinâmica do que roGFP1 24,26. Estudos em Arabidopsis thaliana indicam que o tempo necessário para responder a alterações no estado redox é similar para ambos os sensores (t ½ para oxidação, 65 e 95 s e t ½ para redução, 272 e 206 segundos, o que roGFP1 e roGFP2, respectivamente) 26. MitGO-ATeam2 é minimamente invasivo, confiávelsensor que mede ATP mitocondrial no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) de sonda, que consiste na subunidade da ε o F F 1-ATP sintase ensanduichada entre dador FRET e proteínas aceitadoras fluorescentes GFP (proteína fluorescente e laranja (OFP), respectivamente), 27. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador FRET em estreita proximidade com o receptor e para permitir a transferência de energia entre o dador eo aceitador. Existem duas variantes da GO-ATeam, GO-ATeam1 e GO-ATeam2. GO-ATeam2 tem uma maior afinidade para MgATP que GO-ATeam1, tornando-o mais adequado para medir o tipicamente inferior [ATP], em comparação com as mitocôndrias do citosol 27. Para sondar estado redox mitocondrial, construiu-se uma proteína de fusão (mito-roGFP1) consistindo de roGFP1 fundido com a sequência líder de um ATP9nd expresso a partir de um centrómero baseado (baixo número de cópias) o plasmídeo de expressão de levedura sob o controlo do forte desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Usamos roGFP1 para sondar o estado redox de mitocôndrias no contexto do envelhecimento do modelo fungo Saccharomyces cerevisiae. Descobrimos que roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial que ocorrem durante o envelhecimento e em resposta a disponibilidade de nutrientes, mas não tem nenhum efeito prejudicial aparente em células de levedura. Vemos também a variabilidade no estado redox de mitocôndrias nas células de leveduras vivas individuais, o que reafirma a importância de um biosensor com resolução espacial subcelular. MitGO-ATeam2 é uma variante da GO-ATeam2, que tem a sequência de sinal mitocondrial do citocromo c oxidase subunidade VIII inserido no terminal amino da GO-ATeam2 27. Nós modificamos o mitGO-ATeam2 sonda (gentilmente cedido pelo laboratório de H. Noji, o Institutof Scientific e Industrial Research, Universidade de Osaka, Japão), para utilização em levedura por subclonagem-lo, através de Xba1 e locais HindIII, no vector de expressão de levedura pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, EUA), que é um plasmídeo de cópia de baixa contendo o promotor GPD constitutivo forte. Expressamos mitGO-ATeam2 em levedura de brotamento, e encontrar, pela coloração de contraste com o DNA-binding corante DAPI, que localiza exclusivamente para a mitocôndria, onde ele serve como uma sonda eficaz para medir as mudanças fisiológicas em níveis de ATP mitocondrial. roGFP e GO-ATeam ambos são geneticamente codificado. Como resultado, eles podem ser introduzidos e mantidos de forma estável em células intactas, e fornecem informações sobre o estado redox, ou os níveis de ATP, em células vivas individuais. Além disso, ambos os biossensores monitorar as alterações no estado redox ou níveis de ATP que ocorrem sob condições fisiológicas. 28 Ambas as sondas são também raciométrica. Como resultado, as medições feitas com estes testes não são afetados por changes na concentração biosensor ou iluminação da amostra ou espessura. Finalmente, ambos os biossensores fornecer resolução espacial subcelular. Com efeito, roGFP foi orientada de mitocôndrias, ER, endossomas e peroxissomas 24, e pode detectar alterações no estado redox de cada um destes organelos, em grande parte independentes do pH.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

As mitocôndrias têm um papel em muitos processos celulares, a partir do metabolismo da energia e homeostase do cálcio para controlar o tempo de vida de celular e morte celular programada. Esses processos afetam e são afetados pelo estado redox e de produção de ATP pela mitocôndria. Aqui, descrevemos o uso de dois, biossensores geneticamente codificados raciométrica que podem detectar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em resolução subcelular em células de levedura viva. Estado redox mitocondrial é medida usando Proteína Fluorescente Verde redox-sensível (roGFP) que é direcionado para a matriz mitocondrial. Mito-roGFP contém cisteínas nas posições 147 e 204 da GFP, que sofrem oxidação e redução reversível e dependente do ambiente, que por sua vez altera o espectro de excitação da proteína. MitGO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância Förster (FRET) sonda em que a subunidade ε da F o F 1 ATP sintase é imprensada entre FRET doador e receptor fluoproteínas rescent. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador e aceitador de FRET em estreita proximidade e permitir a transferência de energia de ressonância de fluorescência do dador ao receptor.

Medindo estado redox mitocondrial com mito-roGFP Aqui, mostramos que mito-roGFP1 tem a gama dinâmica para detectar alterações no estado redox mitocondrial de totalmente oxidado a reduzida em células de levedura viva, sem afetar o crescimento de células de levedura ou morfologia mitocondrial. Primeiro, encontramos células que expressam GFP mitocôndrias-alvo e roGFP1 crescer a taxas normais (Figura 1A). A taxa de crescimento máxima, tal como medido pelo declive máximo da...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Descreve-se a utilização de dois raciométrica, biossensores codificados geneticamente, que são baseados em GFP, para monitorar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP na resolução subcelular em células vivas.

Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Bioengenharia

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Imagem Lifetime fluorescência de rotores moleculares em células vivas

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Sensor de microagulhas baseado oco para Multiplexed Transdermal Eletroquímica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...