Name: ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells
Uploaded: 2013-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана награды от HHMI 56006760 в JDV, Национального института здоровья (NIH) (2 TL1 RR 24158-6), чтобы DMAW, а с Эллисон Медицинский фонд (AG-SS-2465) и NIH (GM45735, GM45735S1 и GM096445) в LP. GM45735S1 была выдана из NIH в оздоровлении американской экономики и реинвестировании 2009 года. Микроскопы используются для этих исследований были частично поддержана через NIH / NCI грант (5 P30 CA13696).

1. Трансформации дрожжевых клеток с Биосенсоры <ol><li> Преобразование нужный штамм дрожжей с плазмиду, несущую митохондрий roGFP или mitGO-ATeam2 методом ацетат лития 27. </li><li> Чтобы подтвердить преобразование с плазмидой биосенсор и предотвратить потерю плазмиды, выбрать и сохранить тран?...

<ol>
	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

Здесь мы описываем методы использовать Mito-roGFP1 и mitGO-ATeam2 в качестве биосенсоров для оценки митохондриальных окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ в живых клетках дрожжей. Мы считаем, что выражение плазмидой Mito-roGFP1 или mitGO-Ateam результатов в количественном ориентации на ?...

Митохондрии являются существенными для органелл производства АТФ, биосинтеза аминокислот, жирных кислот, гем, железо серные кластеры и пиримидинов. Митохондрии также играют ключевую роль в гомеостазе кальция, а в регуляции апоптоза. 1 больше доказательств ссылки митохондрии старения и возрастных заболеваний, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз и болезнь Хантингтона. 2 В то время как люди живут всю свою жизнь с мутации в митохондриальных белков, которые связаны с нейродегенеративные заболевания, симптомы болезни возникают только в будущем. Это означает, что изменения происходят в митохондриях с возрастом, которые позволяют патологии болезни появляться. Действительно, митохондриальная фитнес коррелирует с общего состояния здоровья и продолжительности жизни клетки дрожжей и в клетках млекопитающих. 3,4 Здесь мы опишем, как использовать генетически кодируемых, логометрических флуоресцентные биосенсоры для оценки двух важных особенностях Митокhondria в живых дрожжевых клеток: окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ. Функции митохондрий в аэробных мобилизации энергии хорошо известна. Митохондриальных окислительно-восстановительное состояние является продуктом сокращения и окислителей в органеллы, в том числе NAD + / NADH, FAD / ГВС 2, NADP + / NADPH, глутатион / глутатион дисульфида (GSH / GSSG) и активные формы кислорода (ROS). Разобщение митохондрии или гипоксия влияет на митохондриальную дыхательную активность и изменяет отношение NAD + до NADH в органеллы. АФК, которые получают из неэффективного переноса электронов между комплексами цепи переноса электронов во внутренней митохондриальной мембраны, а также от дезаминирование аминов через моноаминоксидазы в наружной мембраны митохондрий 5, повреждения липиды, белки и нуклеиновые кислоты и имеют были связаны со старением и связанных с возрастом нейродегенеративных заболеваний 6,7,8. ROS также играют важную роль в передаче сигнала в мitochondria, через окисление GSH. Например, NADH дегидрогеназы не только способствует продукции АФК, но и регулируется за счет взаимодействия с бассейном глутатиона 9,10. α-кетоглутаратдегидрогеназы и аконитазу, компоненты ЦТК, проявляют пониженную активность в окислительных средах 11,12. Действительно, окислительно-восстановительный потенциал-зависимого регулирования аконитазу активность сохраняется от бактерий до млекопитающих 13,14. Таким образом, наблюдая окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ митохондрий крайне важно для понимания их функции и роль в патологии болезни. Биохимические методы были использованы для оценки окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ целых клеток или изолированными митохондриями. Широко используются методы оценки окислительно-восстановительное состояние целых клеток или изолированных митохондрий, основанные на измерении уровней окислительно-восстановительной пары GSH / GSSG 15. Люциферин-люциферазы системы обычно используют для измерения митохондриальнойУровней АТФ в любом проницаемыми целых клеток или изолированных митохондрий. 16,17,18,19,20 В этом анализе люциферазы связывается с АТФ и катализирует окисление и хемилюминесценции с люциферин. 21 интенсивность излучаемого света пропорциональна количеству АТФ в реакционной смеси. 22 Эти методы показали основную информацию о функции митохондрий, включая обнаружение того, что пациенты с нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, имеют аномально низких уровней АТФ. 23 Тем не менее, они не могут быть использованы для изображения жизни, интактных клеток. Кроме того, методы, основанные на цельноклеточной анализа обеспечивают в среднем окислительно-восстановительное состояние или уровень АТФ во всех отсеках ячейки. Измерения в изолированных органелл являются потенциально проблематично из-за митохондриальных окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ может изменяться в процессе внутриклеточного фракционирования. Наконец, недавние исследования, проведенные в нашей лаборатории и другие показывают, чтомитохондрий в отдельные клетки являются гетерогенными в функции, которые в свою очередь влияет на продолжительность жизни матери и дочерним клеткам. 3 Таким образом, существует необходимость измерения митохондриальной АТФ и окислительно-восстановительное состояние в живых клетках с субклеточных разрешение. Биосенсоры для митохондриальной функции, описанные здесь, как на основе GFP. Редокс-чувствительный GFP (roGFP) 24,25 GFP является вариант, в котором экспонированы на поверхности цистеина добавляют в молекуле. roGFP, как дикого типа GFP, имеет два пика возбуждения (при ~ 400 нм и ~ 480 нм) и один пик излучения при ~ 510 нм. Окисление остатков цистеина в roGFP приводит к увеличению возбуждение при ~ 400 нм. Сокращение этих цистеина способствует возбуждению при ~ 480 нм. Таким образом, отношение 510 нм, излучение при возбуждении roGFP при 480 нм и 400 нм показывает относительное количество восстановленной и окисленной roGFP, которая отражает окислительно-восстановительное состояние окружающей среды флуорофор о. Два испионами roGFP широко используются: roGFP1 и roGFP2. Оба содержат те же вставки цистеина. roGFP1 на основе дикого типа GFP и roGFP2 основана на S65T GFP, который имеет более эффективное возбуждение при 480 нм и менее эффективное возбуждение при 400 нм по сравнению с wtGFP 24. roGFP1 меньше, чем рН-чувствительные roGFP2 и его динамический диапазон простирается далее в диапазоне значений приведенного. Таким образом, roGFP1 может быть более полезным для мониторинга более восстанавливающих отсеки, такие как митохондрии или цитозоле, и отсеков с переменным рН, такие как эндосомам. roGFP2 имеет более яркое сигнала и, в некоторых исследованиях, больший динамический диапазон, чем roGFP1 24,26. Исследования, проведенные в Arabidopsis THALIANA показывают, что время, требуемое для реакции на изменения в окислительно-восстановительное состояние одинакова для обоих датчиков (т ½ для окисления, 65 и 95 сек и т ½ для уменьшения, 272 и 206 сек, для roGFP1 и roGFP2, соответственно). 26 MitGO-ATeam2 является малоинвазивным, надежныедатчик, который измеряет митохондриальной АТФ в начинающие CEREVISIAE дрожжей Saccharomyces. GO-Ateam является энергии Ферстера резонансной передачи (FRET) зонд, который состоит из ε-субъединицы F о F 1-АТФ-синтазы FRET зажатой между донором и акцептором флуоресцентного белка (GFP и оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) соответственно) 27. Связывание АТФ с ε субъединицы приводит конформационные изменения в белке, которые приносят лад донора в непосредственной близости от акцептора и позволяют передачу энергии от донора к акцептора. Есть два варианта GO-Ateam, GO-GO и ATeam1-ATeam2. GO-ATeam2 имеет более высокое сродство к MgATP чем GO-ATeam1, что делает ее более пригодной для измерения обычно ниже, [АТФ] в митохондриях по сравнению с цитозоль 27. Для зондирования митохондриальных окислительно-восстановительного состояния, мы построили слитого белка (Mito-roGFP1), состоящий из roGFP1 слитый с последовательностью лидера ATP9й экспрессируется из центромеры основе (низкое число копий), дрожжевой экспрессирующий плазмиду под контролем сильного глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GPD) промотор (p416GPD, Addgene). Мы использовали roGFP1 для исследования окислительно-восстановительного состояния митохондрий в контексте старения CEREVISIAE модель грибок cerevisiae. Мы считаем, что roGFP1 может обнаружить изменения в митохондриальных окислительно-восстановительного состояния, которые происходят в процессе старения и в ответ на наличие питательных веществ, но не имеет никакой очевидной пагубное влияние на дрожжевые клетки. Мы также видим, изменчивость в окислительно-восстановительного состояния митохондрий в индивидуальные клетки дрожжей жизни, открытие, которое подчеркивает важность биосенсоров субклеточную с пространственным разрешением. MitGO-ATeam2 является вариант GO-ATeam2, который имеет сигнальную последовательность митохондриальной цитохром с оксидазы субъединицы VIIIA вставляется в аминоконцу GO-ATeam2. 27 Мы изменили mitGO ATeam2-зонд (любезно предоставленные лабораторией H. Noji, Институт OF научных и промышленных исследований, Университет Осака, Япония) для использования в дрожжах субклонированием к ней через Xba1 и HindIII сайтах, в вектор экспрессии дрожжей pAG415GPD-БДКК (Addgene, Кембридж, Массачусетс, США), которая является низкой плазмидой содержащие сильного конститутивного промотора GPD. Мы выразили mitGO-ATeam2 у почкующихся дрожжей, и найти, по контрастного с ДНК-связывающим красителем DAPI, что он локализуется исключительно в митохондрии, где он служит эффективным зондом для измерения физиологических изменений в митохондриальной уровня АТФ. roGFP и GO-Ateam оба генетически закодированы. В результате, они могут быть введены и стабильно сохраняться в интактных клетках, и предоставлять информацию о окислительно-восстановительное состояние или уровней АТФ в отдельных, живые клетки. Более того, и биосенсоров отслеживать изменения в окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ, которые происходят в физиологических условиях. +28 Оба зонда также радиометрические. В результате измерений, выполненных с этих зондов не влияет на чаНГРЭС биосенсоров в концентрации или освещения образца или толщины. Наконец, и биосенсоры обеспечить субклеточных пространственным разрешением. Действительно, roGFP была ориентирована в митохондрии, ER, эндосомы и пероксисом 24, и может обнаружить изменения в окислительно-восстановительное состояние каждого из этих органелл, в значительной степени зависит от рН.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

Митохондрии играют роль во многих клеточных процессах, с метаболизмом энергии и гомеостаз кальция для контроля клеточной продолжительность жизни и запрограммированной клеточной смерти. Эти процессы влияют и зависят от окислительно-восстановительного статуса и АТФ в митохондриях. Здесь мы описываем использование двух логометрических, генетически кодируемых биосенсоры, которые могут обнаружить митохондриальных окислительно-восстановительное состояние и уровни АТФ в субклеточные разрешение в живых клетках дрожжей. Митохондриальных окислительно-восстановительное состояние измеряется с использованием окислительно-восстановительных чувствительной зеленый флуоресцентный белок (roGFP), который направлен на митохондриях. Mito-roGFP содержит цистеина в положениях 147 и 204 GFP, которые подвергаются обратимым и экологически зависимой окисления и восстановления, которые в свою очередь изменяют спектр возбуждения белка. MitGO-Ateam является энергией резонанса Ферстера переводом (лад) датчик, в котором ε субъединицы F O F 1-АТФ-синтазы зажат между FRET донором и акцептором флуоресцентныхrescent белков. Связывание АТФ с ε субъединицы приводит к изменениям в конформации белка, которые приносят лад донора и акцептора в непосредственной близости и позволяют резонансный перенос энергии флуоресценции с донора на акцептор.

Измерение митохондриальных окислительно-восстановительного состояния митохондрий-roGFP Здесь мы показываем, что Мито-roGFP1 имеет динамический диапазон для обнаружения изменений в митохондриальных окислительно-восстановительное состояние от полностью окисляется до умен?...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Мы опишем использование двух логометрических, генетически кодируемых биосенсоров, которые основаны на GFP, следить митохондриальных окислительно-восстановительное состояние и уровни АТФ в субклеточные разрешение в живых клетках дрожжей.

Логометрический биосенсоры, которые измеряют митохондриальных окислительно-восстановительного состояния и АТФ в живых клетках дрожжей

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Изготовление Электрохимические ДНК-биосенсоры для Безреагентная Обнаружение нуклеиновых кислот, белков и малых молекул

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Флуоресценции жизни молекулярных роторов в живых клетках

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Пространственно-временные манипуляции малых активность ГТФ на субклеточном уровне, и на шкале времени секунды в живых клетках

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Полые микроиглы на основе датчиков для электрохимических мультиплексный Трансдермальные зондирования

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Оптический Обнаружение<em&gt; Е. палочка</em&gt; Бактерии по Мезопористые Silicon биосенсоров

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Выделение сотовых липидные капли: Два Методы очистки Начиная с дрожжевых клеток и правам плаценты

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Оптический контроль живых клеток электрической активности по сопряженных полимеров

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

Протокол по использованию Ферстер Resonance Energy Transfer (FRET) -Force биосенсоров для измерения механических сил по всему комплексу ядерного ЛИНКА

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Использование синтетической биологии инженеру живых клеток, которые взаимодействуют с программируемыми материалов

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...