Name: ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells
Uploaded: 2013-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av utmärkelser från HHMI 56006760 till JDV, National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24.158-6) till DMAW, och från Ellison Medical Foundation (AG-SS-2465) och NIH (GM45735, GM45735S1 och GM096445) till LP. GM45735S1 utfärdades från NIH enligt den amerikanska Återvinning och Reinvestment Act från 2009. De mikroskop som används för dessa studier stöddes delvis genom en NIH / NCI bidrag (5 P30 CA13696).

Ett. Transformation av jästceller med Biosensors <ol><li> Förvandla önskad jäststam med plasmiden bärande Mito-roGFP eller mitGO-ATeam2 med metoden litiumacetat 27. </li><li> För att bekräfta transformation med plasmidburna biosensor och för att förhindra förlust av plasmiden, välja och upprätthålla transformanter på lämpligt selektivt syntetiskt komplett medium (SC-Ura för mito-roGFP, eller SC-Leu för mitGo-ATeam2). Om den fluorescerande sonden har subklonats i en annan plasmid än de som ...

<ol>
	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

Här beskriver vi metoder att använda Mito-roGFP1 och mitGO-ATeam2 som biosensorer för att bedöma mitokondrie redoxtillstånd och ATP-nivåer i levande jästceller. Vi finner att uttrycket av plasmidburna Mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam resulterar i kvantitativ inriktning till mitokondrierna, utan någon uppenbar effekt på mitokondriell morfologi eller distributionen eller på cellulär tillväxt. 3 Mito-roGFP1 kan upptäcka förändringar i mitokondriernas redoxtillstånd från starkt oxideras till mycket ...

Mitokondrierna är viktiga organeller för ATP-produktion, biosyntes av aminosyror, fettsyror, häm, järn svavel kluster och pyrimidiner. Mitokondrierna spelar också avgörande roller i kalciumhomeostas, och i regleringen av apoptos. 1 öka kontakterna bevis mitokondrier till åldrande och åldersrelaterade sjukdomar som Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, amyotrofisk lateralskleros, och Huntingtons sjukdom. 2 Medan individer lever hela sina liv med mutationer i mitokondriernas proteiner som är associerade med neurodegenerativa sjukdomar, sjukdomssymptom uppstår först senare i livet. Detta indikerar att förändringar sker i mitokondrier med åldern som tillåter sjukdomspatologin att dyka. Faktum är mitokondrie fitness korrelerad med total cell hälsa och livslängd i jäst och däggdjursceller. 3,4 Här beskriver vi hur du använder genetiskt kodade, ratiometrisk fluorescerande biosensorer för att bedöma två viktiga funktioner i mitochondria i levande jästceller: redoxtillstånd och ATP-nivåer. Mitokondriell funktion i aerob energi mobilisering är väl etablerad. Mitochondrial redoxtillstånd är en produkt av reducerande och oxiderande arter i organell, inklusive NAD + / NADH, FAD / FADH2, NADP + / NADPH, glutation / glutation disulfid (GSH / GSSG) och reaktiva syrespecies (ROS). Uncoupling mitokondrier eller hypoxi påverkar mitokondriella andningskedjan aktivitet och förändrar förhållandet mellan NAD + till NADH i organell. ROS, som framställts av ineffektiva elektron överföring mellan komplex av elektron transportkedjan i det inre mitokondrie membranet, samt från deamineringen av aminer via monoaminoxidas i yttre mitokondriemembranet 5, lipider skador, proteiner och nukleinsyror och har varit kopplade till åldrande och åldersrelaterade associerade neurodegenerativa sjukdomar 6,7,8. ROS spelar också en roll i signaltransduktion i mitochondria, genom oxidation av GSH. Till exempel, NADH dehydrogenas inte bara bidrar till ROS produktion men också regleras genom interaktioner med glutation pool 9,10. α-ketoglutarat dehydrogenas och Aconitase, komponenter i TCA-cykeln, uppvisar minskad aktivitet i oxiderande miljöer 11,12. Faktum är redox-beroende reglering av Aconitase aktivitet bevarad från bakterier till däggdjur 13,14. Således, övervaka redoxtillståndet och ATP nivåer av mitokondrier är avgörande för att förstå deras funktion och roll i sjukdom patologi. Biokemiska metoder har använts för att bedöma redoxtillståndet eller ATP-nivåer av hela celler eller isolerade mitokondrier. Använda metoderna för att bedöma redoxtillståndet av hela celler eller isolerade mitokondrier bygger på att mäta nivåerna av den redoxpar GSH / GSSG 15. Luciferin-luciferas-systemet används ofta för att mäta mitokondrieATP-nivåer i antingen permeabiliserade hela celler eller isolerade mitokondrier. 16,17,18,19,20 i denna analys, binder luciferas till ATP och katalyserar oxidationen av och kemiluminescens från luciferin. 21 Intensiteten av det utsända ljuset är proportionell mot mängden av ATP i reaktionsblandningen. 22 Dessa metoder har avslöjat grundläggande information om mitokondriell funktion, inklusive den slutsatsen att patienter med neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, har onormalt låga ATP-nivåer. 23 Men de kan inte användas för att avbilda levande, intakta celler. Dessutom, metoder baserade på helcell-analys ger ett genomsnitt av redoxtillstånd eller ATP-nivåer i alla fack i cellen. Mätningar i isolerade organeller är potentiellt problematiskt eftersom mitokondrie redoxtillstånd eller ATP-nivåer kan ändras under subcellulär fraktionering. Slutligen, nya studier från vårt laboratorium och andra visar attmitokondrier inom enskilda celler är heterogena i funktion, vilket i sin tur påverkar livslängden på mor och dotter-celler. 3 Det finns således ett behov av att mäta mitokondrie ATP-halter och redoxtillstånd i levande celler med subcellulär upplösning. De biosensorer för mitokondriell funktion beskrivs här är båda baserade på GFP. Redox-känslig GFP (roGFP) 24,25 är en GFP variant där ytexponerade cysteiner tillsättes till molekylen. roGFP, liksom vildtyps-GFP, har två excitations topparna (vid ~ 400 nm och ~ 480 nm) och en emissionstopp vid ~ 510 nm. Oxidation av cysteinresterna i roGFP resulterar i en ökning av excitation vid ~ 400 nm. Minskning av dessa cysteiner gynnar excitation vid ~ 480 nm. Sålunda avslöjar förhållandet 510 nm emission vid excitering av roGFP vid 480 nm och 400 nm den relativa mängden av reducerad och oxiderad roGFP, som återspeglar redoxtillstånd av fluoroforen miljö. Två versjoner av roGFP används ofta: roGFP1 och roGFP2. Båda innehåller samma cystein infogningar. roGFP1 baseras på naturligt GFP och roGFP2 baseras på S65T GFP, som har mer effektiv excitation vid 480 nm och mindre effektiv excitation vid 400 nm jämfört med wtGFP 24. roGFP1 är mindre pH-känslig än roGFP2 och dess dynamiska omfång sträcker sig vidare in i den reducerade intervall. Således kan roGFP1 vara mer användbara för övervakning mer reducerande fack såsom mitokondrier eller cytosolen och delområden med varierande pH, såsom endosomer. roGFP2 erbjuder ljusare signal och, i vissa studier, ett större dynamiskt omfång än roGFP1 24,26. Studier i Arabidopsis thaliana tyder på att den tid som krävs för att svara på förändringar i redoxtillstånd är likartad för båda sensorerna (t ½ för oxidation, 65 och 95 sekunder och t ½ för reduktion, 272 och 206 sek, för roGFP1 och roGFP2, respektive). 26 MitGO-ATeam2 är en minimalt invasiv, tillförlitligsensor som mäter mitokondriell ATP i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam är en Förster resonance energy transfer (FRET) sond som består av ε-subenheten av F o F 1-ATP-syntas inklämt mellan FRET donator-och acceptor-fluorescerande proteiner (GFP och orange fluorescerande protein (OFP), respektive). 27 Bindning av ATP till resultaten ε subenheten i konformationsförändringar i proteinet som ger FRET donator i nära anslutning till acceptorn och möjliggöra energiöverföring från donator till acceptor. Det finns två varianter av GO-ATeam, GO-ATeam1 och GO-ATeam2. GO-ATeam2 har en högre affinitet för MgATP än GO-ATeam1, vilket gör den mer lämplig för mätning av den typiskt lägre [ATP] i mitokondrier i förhållande till cytosolen. 27 Att söka mitokondriella redoxtillstånd, konstruerade vi ett fusionsprotein (mito-roGFP1) bestående av roGFP1 fuserad till ATP9 ledarsekvensen ennd uttryckt från en centromer-baserad (lågt kopietal) jästexpressionsplasmid under kontroll av den starka glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GPD)-promotorn (p416GPD, Addgene). Vi använde roGFP1 att sondera redox status mitokondrier i samband med åldrandet av modellen svampen Saccharomyces cerevisiae. Vi finner att roGFP1 kan upptäcka förändringar i mitokondriell redoxtillstånd som inträffar under åldrande och som svar på tillgången på näringsämnen men har ingen uppenbar skadlig effekt på jästceller. Vi ser även variabilitet i redoxtillståndet av mitokondrier inom enskilda celler levande jäst, ett konstaterande som understryker vikten av en biosensor med subcellulär rumslig upplösning. MitGO-ATeam2 är en variant av GO-ATeam2, som har den mitokondriella signalsekvensen av cytokrom c oxidas subenhet VIIIA insatt vid aminoterminalen av GO-ATeam2. 27 Vi modifierade den mitGO-ATeam2 sond (tillhandahölls vänligt av laboratoriet av H. Noji, institf vetenskaplig och industriell forskning, Osaka University, Japan) för användning i jäst genom subkloning det, via Xba1 och Hindlll, i jästexpressionsvektor pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), vilket är en låg-kopia plasmid innehåller den starka konstitutiva GPD promotor. Vi uttryckte mitGO-ATeam2 i spirande jäst, och finna, genom motfärgning med DNA-bindande färgämne DAPI, att den lokaliserar uteslutande till cellernas mitokondrier där det fungerar som ett effektivt sond för att mäta fysiologiska förändringar i mitokondriella ATP-nivåer. roGFP och GO-ATeam är både genetiskt kodade. Som ett resultat, kan de införas och bibehållas stabilt i intakta celler, och ger information om redoxtillstånd eller ATP-nivåer i enskilda, levande celler. Dessutom är båda biosensorer övervaka förändringar i redoxtillstånd eller ATP-nivåer som förekommer under fysiologiska förhållanden. 28 Båda sonderna är också ratiometrisk. Som ett resultat, är mätningar gjorda med dessa sönder påverkas inte av changes i Biosensor koncentration eller provbelysning eller tjocklek. Slutligen, båda biosensorer ger subcellular rumslig upplösning. Sannerligen, har roGFP varit riktade till mitokondrier, ER, endosomer och peroxisomerna 24, och kan upptäcka förändringar i redox tillståndet för var och en av dessa organeller, till stor del oberoende av pH.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

Mitokondrierna har roller i många cellulära processer, från energiomsättning och kalciumhomeostas att styrningen av cellernas livslängd och programmerad celldöd. Dessa processer påverkar och påverkas av den redox status och ATP produktionen av mitokondrier. Här beskriver vi användandet av två ratiometrisk, genetiskt kodade biosensorer som kan upptäcka mitokondriell redoxtillstånd och ATP-nivåer vid subcellulärt upplösning i levande jästceller. Mitokondriell redoxtillstånd mäts med redox-känsliga grönt fluorescerande protein (roGFP) som är riktad till den mitokondriella matrisen. Mito-roGFP innehåller cysteiner i positionerna 147 och 204 av GFP, som genomgår reversibel och miljö-beroende oxidation och reduktion, vilket i sin tur förändrar excitationsspektrumet av proteinet. MitGO-ATeam är en Förster resonance energy transfer (FRET) sond i vilken ε-subenheten av F o F 1-ATP-syntas är inlagt mellan FRET donator och acceptor fluorescent proteiner. Bindning av ATP till resultaten ε subenheten i konformationsförändringar i proteinet som ger FRET donator och acceptor i omedelbar närhet och möjliggöra fluorescensresonansenergiöverföring från donatorn till acceptorn.

Mätning mitokondrie redoxtillstånd med mito-roGFP Här visar vi att mito-roGFP1 har det dynamiska området för att upptäcka förändringar i mitokondriernas redoxtillstånd från helt oxideras till minskade i levande jästceller, utan att påverka tillväxten jäst cell eller mitokondriell morfologi. Först hittar vi celler som uttrycker mitokondrier riktade GFP och roGFP1 växa i normal takt (Figur 1A). Den högsta tillväxttakten, mätt som maximal lutning på tillväxtku...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Vi beskriver användningen av två ratiometrisk, genetiskt kodade biosensorer, som är baserade på GFP, för att övervaka mitokondrie redoxtillstånd och ATP-nivåer vid subcellulärt upplösning i levande jästceller.

Propportionell Biosensors som mäter Mitokondriell redoxtillstånd och ATP i Living jästceller

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Tillverkning av elektrokemiska-DNA biosensorer för att Reagentless Upptäckt av nukleinsyror, proteiner och små molekyler

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Fluorescens Lifetime Imaging of Molecular Rotorer i levande celler

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Tid och rum Manipulering av små GTPas aktivitet på Subcellulär nivå och Tidsplan sekunder i levande celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Ihåliga mikronål-baserad sensor för Multiplexade Transdermal Elektrokemisk Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mätning av mekaniska egenskaper i levande celler Använda Atomkraftsmikroskopi

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optisk detektering av<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterier av Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Isolering av Cellular Lipid Droppar: Två reningstekniker Betyg från jästceller och mänskliga moderkakor

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk kontroll av levande celler elektrisk aktivitet av konjugerade polymerer

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

Ett protokoll för användning av Förster resonansenergiöverföring (FRET) -force Biosensorer för att mäta mekaniska krafter över Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Använda Syntetisk biologi ingenjör levande celler som har gränssnitt programmerbara material

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...