Name: label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis
Uploaded: 2013-09-03T14:00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis at JoVE.com

समर्थित यह काम राष्ट्रीय विज्ञान अनुदान सं EFRI 0938047 के तहत फाउंडेशन, और क्रिटिकल प्रौद्योगिकी और एप्लाइड साइंस के लिए वर्जीनिया टेक संस्थान द्वारा (ICTAS) द्वारा भाग में समर्थित किया गया है. लेखकों मोसे एल कोशिकाओं के अपने तरह का उपहार के लिए डॉ. ईवा Schmelz और डॉ. पॉल रॉबर्ट्स को प्रशंसा व्यक्त करना चाहते हैं. लेखकों उसे इस दस्तावेज़ को संपादित करने और प्रयोगों की तैयारी के साथ उसकी मदद के लिए सेल संस्कृति, Caitlan Swaffar साथ सहायता, और सभी Bioelectromechanical सिस्टम लैब के सदस्यों के लिए एंजेला एंडरसन को स्वीकार करते हैं.

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डॉ. राफेल Davalos संपर्क dielectrophoresis के लिए पेटेंट लंबित है.

रवानगी कणों की ढांकता हुआ गुण का निर्धारण और, अलगाव, या संवर्धन अनुप्रयोगों छँटाई के प्रति कण गति निर्देशन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. कारण एक नमूना के साथ सीधे इलेक्ट्रोड संपर्क के हानिकारक प्रभाव को, दूसरों के संपर्क से बचने के लिए पहले से प्रस्तुत विधि के समान दृष्टिकोण ले लिया है. उदाहरण के लिए, बशीर एट अल. एक पतली गिलास coverslip द्वारा मुद्रित सर्किट बोर्ड इलेक्ट्रोड से अलग एक microfluidic PDMS डिवाइस का उपयोग करके संपर्क मुक्त रवानगी उपकरणों का विकास किया है, और इस तकनीक को भी वीडियो प्रारूप में उपलब्ध कराया गया है. 23,36 यहाँ, हम एक एकल PDMS सब्सट्रेट का उपयोग एक cDEP चिप और fluidic इलेक्ट्रोड का निर्माण, और कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट मोती का एक मिश्रण से डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पता चला है. प्रस्तुत तकनीक को सफलतापूर्वक लिव छँटाई सहित अधिक जटिल और physiologically प्रासंगिक अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया गया हैई और मृत कोशिकाओं, 28 ट्यूमर प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं से कोशिकाओं की शुरुआत कमजोर लाल रक्त कोशिकाओं, 31,32 और स्तन कैंसर के 37 और डिम्बग्रंथि के कैंसर के चरणों के बीच फर्क से 30 कैंसर कोशिकाओं. 29 cDEP भी कणों के मिश्रण के लिए इस्तेमाल किया गया है. 38 इन आवेदन पत्र प्रस्तुत सरल तकनीक का उपयोग करके, विविध उद्देश्यों चैनल ज्यामिति का डिजाइन बदलकर बस पूरा किया जा सकता है. . रवानगी कणों गोलाकार कण के लिए 13 के हेरफेर के लिए microscale पर उपयोगी है, translational dielectrophoretic बल आकार और बिजली के कण और इसकी निलंबित माध्यम के गुण, साथ ही बिजली क्षेत्र की ढाल चुकता पर निर्भर करता है: <img alt="1 समीकरण" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> ε एम निलंबित मध्यम के permittivity है जहां, आर त्रिज्या हैकण की, और आर सी [कश्मीर (ω)] Clausius-Mossotti (मुख्यमंत्री) कारक के असली हिस्सा है. मुख्यमंत्री कारक निलंबित मध्यम की तुलना में कण के रिश्तेदार polarizability का एक उपाय है और dielectrophoretic बल की दिशा निर्धारित करता है. यह रूप में वर्णित है <img alt="2 समीकरण" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> जहां <img alt="3 समीकरण" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" /> और <img alt="समीकरण 4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" /> क्रमशः कण और मध्यम, के जटिल permittivities हैं. जटिल permittivity, <img alt="5 समीकरण" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> , चालकता (σ) और आवृत्ति (ω) पर निर्भर करता है. गोलाकार कणों की मुख्यमंत्री कारक सैद्धांतिक रूप -0.5 और 1 के बीच ही है. मुख्यमंत्री कारक नकारात्मक है, तो मध्यम कण से भी अधिक polarizable है, तो कणों क्षेत्रों की से दूर ले जाते हैं, क्योंकि कणों nDEP अनुभवउच्च बिजली के क्षेत्र ढ़ाल. मुख्यमंत्री कारक सकारात्मक है, तो कणों मध्यम से अधिक polarizable हैं और वे उच्च बिजली के क्षेत्र ढ़ाल के क्षेत्रों की ओर कदम जिसमें pDEP अनुभव. ऐसी कोशिकाओं के रूप में संरचना में nonhomogeneous हैं कि जैविक कणों के लिए, Clausius-Mossotti कारक कण permittivity के लिए एक प्रभावी मूल्य से निर्धारित किया जा सकता है: <img alt="समीकरण 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> जहां <img alt="समीकरण 7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" /> और <img alt="समीकरण 8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" /> क्रमशः ऐसी कोशिका द्रव्य के रूप में सेल के इंटीरियर,, और प्लाज्मा झिल्ली, के प्रभावी जटिल permittivity की जटिल permittivity हैं;. आर सेल की त्रिज्या है, और डी प्लाज्मा झिल्ली की मोटाई है 26 रवानगी एक में निलंबित कणों के साथ होता हैतरल पदार्थ, तरल पदार्थ के कण रिश्तेदार की गति कण पर एक खींचें बल उत्पन्न होगा. कण पर अभिनय समग्र बल निर्धारित करते समय इस खींचें बल पर विचार किया जाना चाहिए. यहाँ ब्याज की स्थितियों के लिए, चिपचिपा बलों पर हावी है और कण, गोलाकार छोटे, और अपेक्षाकृत कम वेग से चल ग्रहण कर रहे हैं, तो &#39;स्टोक्स खींचें कानून खींचें बल के लिए एक अच्छा सन्निकटन प्रदान करता है: <img alt="समीकरण 9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> η तरल पदार्थ का चिपचिपापन है जहां, यू पी कण का वेग है, और यू एफ भी चलती हो सकता है जो तरल पदार्थ के वेग है. Dielectrophoretic बल, तरल पदार्थ और कण गुण जाना जाता है, और एक ज्ञात प्रवाह वेग को देखते हुए, खींचें बल और dielectrophoretic बल के बीच संतुलन कण वेग आकलन करने के लिए हल किया जा सकता है. कोशिकाओं अनुभव सीमा से नीचे होना चाहिए कि कतरनी दर जो सी मेंपक्ष lysing हो सकता है. कणों की बिजली के गुणों की विशेषता भविष्यवाणी और वे रवानगी के तहत उन्हें कैसे प्रतिक्रिया करेगा नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है. इस काम में, हम विशेष रूप से कोशिकाओं की पहली अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए मोसे एल कोशिकाओं के साथ कम आवृत्ति cDEP उपयोग किया है, और फिर उनके विरोध रवानगी प्रतिक्रियाओं पर आधारित polystyrene मोती और मोसे एल कोशिकाओं की निरंतर छँटाई दिखाया. CDEP डिवाइस की ज्यामिति उपकरणों उच्च आवृत्ति या कम आवृत्ति आपरेशन के लिए तैयार करने की अनुमति, बिजली क्षेत्र के स्थानिक ढ़ाल बदलने के लिए, और उच्च चयनात्मकता और एक निर्दिष्ट सेल प्रकार के लिए छँटाई की दक्षता के लिए होगा फेरबदल. साथ ही, उच्च throughput उपकरणों व्यापक चैनलों fabricating द्वारा विकसित किया जा सकता है, समानांतर, 30 में या इलेक्ट्रोड चैनलों खड़ी एक अपेक्षाकृत गहरे ऊपर और नीचे खड़ी दिखती हैं जिसमें बहुपरत निर्माण 35, 30 चैनलोंनमूना चैनल. पतली झिल्ली परतों के बीच अवरोध के रूप में. Polymethylmethacrylate (PMMA) और पॉली कार्बोनेट में गढ़े उपकरणों के साथ प्रारंभिक परीक्षण (पीसी) पतली फिल्मों मोसे एल कोशिकाओं की रवानगी प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया है. वर्तमान प्रयासों बहु परत उच्च throughput उपकरणों को निखारने के लिए और एक अंतिम प्लग और खेलने के मंच की ओर परिधीय प्रणाली में सुधार के लिए चल रहे हैं. प्रस्तुत बुनियादी प्रयोगात्मक तकनीक से विस्तार करने के लिए, डिवाइस के अनुप्रयोगों और विशिष्टताओं को इस तरह के लक्षण वर्णन बनाम छँटाई, या उपकरण के लिए नमूना जलाशयों और एक अर्द्ध स्वचालित प्रणाली को जोड़ने के रूप में विशेष मांग है, फिट अनुरूप किया जा सकता है.

जैविक नमूने संवर्धन और कण छँटाई बाद के विश्लेषण के लिए अक्सर आवश्यक है. 1 उदाहरण के लिए, शरीर के तरल पदार्थ से दुर्लभ कोशिकाओं के अलगाव के कैंसर का पता लगाने और व्यक्तिगत चिकित्सा में महत्वपूर्ण आवेदन किया है. 2,3 सबसे अधिक इस्तेमाल संवर्धन तकनीक छँटाई फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल हैं (FACS ) 4 और चुंबकीय सक्रिय कक्ष (एमएसीएस), कोशिकाओं को अलग करने के लिए व्यक्त की सतह मार्करों पर भरोसा है, जो 5 छँटाई. अन्य रणनीतियों hydrodynamic 6 या Inertial 7,8 छँटाई, ऑप्टिकल चिमटी, 9 acoustophoresis, 10 और dielectrophoresis शामिल हैं. 11,12 dielectrophoresis एक गैर वर्दी बिजली क्षेत्र की उपस्थिति में एक polarized कण का आंदोलन है. 13 रवानगी के लिए इस्तेमाल किया गया है आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला, 2,14 व्यवहार्यता, 15 कोशिकाओं के bioelectrical गुण निस्र्पक पर आधारित छँटाई कोशिकाओं सहित, 16 और क्रमबद्ध करेंकोशिकाओं के biophysical गुणों में परिवर्तन प्रेरित पर आईएनजी. 17,18 पारंपरिक रवानगी एक वोल्टेज लागू करते हैं और यह एक शक्तिशाली तकनीक है जबकि एक गैर वर्दी बिजली के क्षेत्र. 13 प्रेरित करने के लिए एक microfluidic चैनल के भीतर नमूनों तलीय इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल, चुनौतियों जैसे, पैदा कर सकते हैं इलेक्ट्रोड delamination और इलेक्ट्रोलिसिस. इन्सुलेटर आधारित dielectrophoresis (iDEP) 19 दूषण, इलेक्ट्रोड delamination, और एक डीसी बिजली के क्षेत्र में गैर uniformities प्रेरित कि patterning इन्सुलेट संरचनाओं के माध्यम से इलेक्ट्रोड क्षेत्र के स्थानिक गिरावट की चुनौतियों को संबोधित किया. iDEP चुनिंदा रहते हैं और मृत बैक्टीरिया कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, 19 बैक्टीरियल बीजाणुओं, 20 और हेरफेर डीएनए, अन्य अनुप्रयोगों के बीच 21 अलग. यह अक्सर आवश्यक उच्च डीसी voltages का एक परिणाम के रूप में हो सकता है क्योंकि जौल हीटिंग एक चुनौती हो सकती है. इन चुनौतियों उन्नति, संपर्क मुक्त रवानगी microdevices विकसित किया गया है. 22-24 <p clasएस = &quot;jove_content&quot;&gt; यहाँ प्रस्तुत तकनीक इतनी धातु इलेक्ट्रोड और नमूना चैनल के बीच सीधे संपर्क की कमी के लिए नामित, contactless dielectrophoresis (cDEP) का इस्तेमाल करता है. इस रणनीति के लिए अद्वितीय 22 से भरा द्रव इलेक्ट्रोड चैनलों के साथ धातु इलेक्ट्रोड के प्रतिस्थापन है एक उच्च प्रवाहकीय समाधान. ये तरल पदार्थ इलेक्ट्रोड capacitively एक एसी वोल्टेज के माध्यम से नमूना चैनल के लिए एक पतली इन्सुलेट बाधा पार मिलकर कर रहे हैं. इलेक्ट्रोड के साथ नमूना संपर्क को खत्म ऐसी इलेक्ट्रोलिसिस और बुलबुला गठन, नमूना संदूषण, और इलेक्ट्रोड delamination रूप रवानगी आधारित विधियों के साथ जुड़े मुद्दों को कम करता है. यह नमूना में कोशिकाओं की व्यवहार्यता का समर्थन करता है क्योंकि एक परिणाम के रूप में, cDEP जैविक नमूने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. महत्वपूर्ण बात है, cDEP नमूना बाँझपन बनाए रख सकते हैं. एक चिप एक सेल संस्कृति हुड में तैयार किया जा सकता है और प्रयोग धातु इलेक्ट्रोड के लिए नमूना संपर्क की आवश्यकता होती है या नमूना environme के लिए खुला हो कि आवश्यकता के बिना आयोजित किया जा सकता हैNT. एक साधारण जलाशय बाँझ नमूना वसूली की सुविधा के लिए चिप आउटलेट के लिए तय किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, नमूना चैनल के रूप में एक ही biocompatible बहुलक सामग्री (PDMS) से तरल पदार्थ इलेक्ट्रोड का निर्माण धातु इलेक्ट्रोड का रिवाज patterning, निर्माण के लिए आवश्यक समय के साथ खर्च की उच्च लागत कम कर देता है, और प्रारंभिक patterning के लिए विशेष cleanroom उपकरण के लिए की जरूरत की सीमा पुन: प्रयोज्य सिलिकॉन वेफर स्टाम्प की. रवानगी की वजह से कणों आंदोलन कण और मध्यम, साथ ही बिजली क्षेत्र के स्थानिक ढ़ाल की विशेषताओं पर निर्भर करता है. एक कण और आवृत्ति पर निर्भर कारक, Clausius-Mossotti (मुख्यमंत्री) कारक कहा जाता है, सीमा -0.5 1 करने में कोई मान लेता है, और रवानगी बल की दिशा निर्धारित करता है. मुख्यमंत्री कारक बिल्कुल शून्य है, जिस पर आवृत्ति अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति कहा जाता है. यह कोई dielectrophoretic बल एक कण और मुख्यमंत्री कारक परिवर्तन साइन पर exerted है जो बिंदु है. एक एसनिष्क्रिय ठोस microspheres के लिए चिमनी के पास अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति तब होता है जब नकारात्मक से सकारात्मक मुख्यमंत्री कारक परिवर्तन 0.01 एस / एम, nDEP से pDEP 10 के पास मौजूद है के लिए एक संक्रमण का संकेत पहले अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति के आदेश पर कम चालकता बफर में स्तनधारी कोशिकाओं के लिए 25. - 100 kHz, और आकार, आकृति, cytoskeleton, और सेल की झिल्ली गुणों से प्रभावित है. 26,27 nDEP शासन को pDEP से एक पारी में एक दूसरे अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति 10 मेगाहर्ट्ज के आदेश पर है, और से प्रभावित है नाभिक-cytoplasm अनुपात, कोशिका द्रव्य चालकता, और जालिका. 27 रवानगी बल द्रव का प्रवाह की उपस्थिति के बिना लागू किया जा सकता है, लेकिन यहाँ हम निलंबित कणों की निरंतर छँटाई प्राप्त करने के लिए एक बह तरल पदार्थ का उपयोग. dielectrophoretic बल और स्टोक्स &#39;खींचें बल के संयुक्त प्रभाव एक कण की translational गति नियंत्रित करती हैं. हम दो आवृत्ति पर्वतमाला में ऑपरेशन के लिए उपकरणों का विकास किया है. उच्च frequencY उपकरणों (100-600 kHz) ऐसे प्रोस्टेट ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं (tics), murine डिम्बग्रंथि सतह उपकला (मोसे) कोशिकाओं, एमडीए MB-231 स्तन कैंसर की कोशिकाओं के रूप में, pDEP और कोशिकाओं का हासिल बैच छँटाई का उपयोग कर संचालित, या THP रहते है चुनिंदा नमूना चैनल में स्थित पदों इन्सुलेट पर ब्याज की कोशिकाओं को फँसाने द्वारा -1 कोशिकाओं. 28-31 कम आवृत्ति (5-100 kHz) उपकरणों लगातार काम करते हैं, और एक आवृत्ति पर संचालित जब एक जनसंख्या पृष्ठभूमि आबादी अनुभवों जबकि pDEP अनुभव करता है, जिस पर nDEP, छँटाई प्राप्त करने के कण trajectories पुनर्निर्देशित कर सकते हैं. 32-34 ये कम आवृत्ति उपकरणों, लाल रक्त कोशिकाओं से कैंसर कोशिकाओं को सॉर्ट एक प्रगतिशील मोसे सेल लाइन की ढांकता हुआ गुण में परिवर्तन का निर्धारण, और की गैर प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है आक्रामक मोसे कोशिकाओं के आक्रामक विशेषताओं पीछे पर विषाक्त sphingolipid उपचार. इसके अतिरिक्त, cDEP microdevices वर्तमान अप करने के लिए 1 मिलीग्राम / एच, बढ़ा throughput में संचालित करने के लिए तैयार किया जा सकता हैआर. 31,35 बताया गया है, लचीलापन और निर्माण की प्रक्रिया की कम लागत प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रक्रिया आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रासंगिक होने की अनुमति जो कस्टम डिजाइन डिवाइस geometries, सक्षम बनाता है. cDEP की लंबी अवधि के लक्ष्य के बाद संस्कृति या प्रसंस्करण के लिए नमूना वसूली के साथ, एक नैदानिक ​​स्तर पर लेबल से मुक्त सेल छँटाई और संवर्धन का एहसास है. यहाँ प्रस्तुत तकनीक रवानगी की पहुंच बढ़ जाती है, जो निर्माण से प्रयोग करने के लिए, एक सरल और सस्ता तरीका है. हम लक्षण वर्णन और फ्लोरोसेंट microspheres से डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के संवर्धन प्राप्त करने के लिए एक cDEP चिप की तैयारी और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>The Microscope Depot</td>
			<td>76079</td>
			<td>2x3 inch-ground edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-06417-31</td>
			<td>Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes</td>
			<td>National Scientific company</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip</td>
			<td>Howard Electronic instruments</td>
			<td>JG20-1.0</td>
			<td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S3-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>112-025-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM, Molecular Probes</td>
			<td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>excitation wavelength 488/emission wavelength 516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B, O</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>SLR1465-100G</td>
			<td>excitation wavelength 540/emission wavelength 625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td>
			<td>RC-147</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica, inverted light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC420, color camera</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DFC420</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td>
			<td>GFG-3015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wideband power amplifier</td>
			<td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td>
			<td>AL-50HF-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFHV Output Transformer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage amplifier</td>
			<td>Trek</td>
			<td>Model 2205</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Modular Oscilloscope, 100 MHz</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>U2701A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001/002 (115/230V)</td>
			<td>air plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>any available width is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>Z708836-25EA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8858</td>
			<td>4.0 &mu;m, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 9260 photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 400 K developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>provided by Virginia Tech cleanroom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coating</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>applied using DRIE machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td>100 mm diameter, 500 &mu;m thickness, one side polished (SSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Reactive Ion Etching (DRIE)</td>
			<td>Alcatrel</td>
			<td>AMS SDE 100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis

Dielectrophoresis (रवानगी) एक गैर वर्दी बिजली के क्षेत्र में कणों translational गति से गुजरना polarized जिसके द्वारा घटना है, और एक सतह मार्कर स्वतंत्र ढंग से microparticles की गति निर्देशित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. परंपरागत रूप से, रवानगी उपकरणों नमूना चैनल में नमूनों तलीय धातु इलेक्ट्रोड शामिल हैं. इस दृष्टिकोण महंगा हो सकता है और एक विशेष cleanroom वातावरण की आवश्यकता कर सकते हैं. हाल ही में, संपर्क dielectrophoresis (cDEP) नामक एक संपर्क मुक्त दृष्टिकोण विकसित किया गया है. इस विधि प्रत्यक्ष patterning fluidic इलेक्ट्रोड से इलेक्ट्रोड और नमूना के बीच संपर्क और एक भी polydimethylsiloxane (PDMS) सब्सट्रेट से एक नमूना चैनल से परहेज करते हुए रवानगी की क्लासिक सिद्धांत का इस्तेमाल, और microparticles सॉर्ट और समृद्ध करने के लिए बनाया गया एक तेजी से microfluidic रणनीति के रूप में आवेदन किया है. इस विधि के लिए अद्वितीय बिजली के क्षेत्र से अलग हो रहे हैं जो एक उच्च प्रवाहकीय तरल पदार्थ युक्त fluidic इलेक्ट्रोड चैनलों के माध्यम से उत्पन्न होता हैएक पतली इन्सुलेट बाधा से नमूना चैनल. धातु इलेक्ट्रोड सीधे नमूना संपर्क नहीं है, इलेक्ट्रोलीज़, इलेक्ट्रोड delamination, और नमूना संदूषण से परहेज कर रहे हैं. साथ ही, यह एक सस्ता और सरल निर्माण की प्रक्रिया में सक्षम बनाता है. cDEP इस प्रकार संवेदनशील जैविक कणों से छेड़छाड़ के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. कणों पर अभिनय dielectrophoretic बल डिवाइस ज्यामिति का अनुकूलन डिजाइन द्वारा उत्पन्न बिजली क्षेत्र के स्थानिक ढ़ाल, लेकिन सेल के आंतरिक biophysical गुणों पर ही नहीं निर्भर करता. जैसे, cDEP अभी bioparticles के लक्षण, संवर्धन, और छँटाई की अनुमति है जबकि फेर से, एक जनसंख्या के भीतर व्यक्त किया जा सकता है कि सतह व्यक्त आणविक बायोमार्कर के आधार पर टाल कि एक लेबल से मुक्त तकनीक है. यहाँ, हम cDEP का उपयोग निर्माण और प्रयोग की मूल बातें प्रदर्शित करता है. हम नरम लिथोग्राफ का उपयोग कर एक cDEP चिप का सरल तैयारी की व्याख्याY तकनीक. हम एक कण या सेल, dielectrophoretic बल शून्य होता है, जिस पर आवृत्ति के अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति निस्र्पक के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया पर चर्चा की. अंत में, हम डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं का एक मिश्रण छँटाई और microspheres (मोती) fluorescing के लिए इस तकनीक के उपयोग के प्रदर्शन.

रवानगी बिजली के क्षेत्र मौजूद है जब डिवाइस कार्य कर रही है इसकी पुष्टि के लिए नमूना चैनल में गुणात्मक मनाया जाना चाहिए. रवानगी की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए एक विधि दूर मजबूत pDEP और nDEP भविष्यवाणी कर रहे हैं, जहां अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति pDEP और एक में सबसे अधिक स्तनधारी कैंसर कोशिकाओं के लिए nDEP निरीक्षण करने के लिए &lt;10 kHz निरीक्षण करने के लिए (लगभग&gt; 40 kHz से मूल्यों को आवृत्ति समायोजित करने के लिए है ) 100 μS / सेमी की चालकता के साथ बफर. यह निष्क्रिय microspheres उनके अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति ऊपर अपने अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति नीचे pDEP प्रदर्शन और nDEP कि ध्यान दिया जाना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत sawtooth सुविधा ज्यामिति के लिए, pDEP कम परीक्षण आवृत्ति पर है, जबकि nDEP, मोती श्रृंखलन और चैनल के sawtooth सुविधा किनारे पर कोशिकाओं या कणों का ध्यान केंद्रित की घटना ने संकेत दिया, उच्च परीक्षण आवृत्ति पर कोशिकाओं के लिए देखा जाना चाहिए कोशिकाओं चैनल के सीधे बढ़त नजदीक क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं के रूप में स्पष्ट होना चाहिए. इन कम आवृत्तियों पर, कोशिकाओं LYS सकता हैकारण electroporation के लिए ई, इसलिए नमूना कम सेल होते दिखाई दे सकते हैं, और एक enzymatically सक्रिय fluorescing डाई का उपयोग अगर दिखाई दे रहे हैं कि उन बढ़े या धुँधली दिखाई दे सकते हैं. PDEP और nDEP होते हैं, जिस पर आवृत्तियों का सत्यापन करना प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति के निर्धारण की अनुमति देता है. यहां इस्तेमाल ऐसी मोसे एल के रूप में स्तनधारी कैंसर की कोशिकाओं, के लिए, हम 60 kHz (चित्रा 5 ब) में 5 kHz (चित्रा 5A) और मजबूत pDEP पर nDEP मनाया. मोसे एल कोशिकाओं 17.7 ± 3.3 माइक्रोन (एन = 268 कोशिकाओं) की एक व्यास था और मोती 4 माइक्रोन नाममात्र व्यास है. प्रगति के पहले चरण में मोसे कोशिकाओं की तुलना में मोसे एल कोशिकाओं की ढांकता हुआ गुण का एक पूरा विश्लेषण Salmanzadeh एट अल. 33 द्वारा हाल ही में काम में पाया जा सकता है PDEP और nDEP इन चरम पर मनाया नहीं कर रहे हैं, विभिन्न समस्याओं उत्पन्न हो सकता है. नमूना चालकता कारण contaminants या सेल lysing को बहुत अधिक हो सकती है. InsufficieNT बिजली के क्षेत्र की वजह से नमूना चैनल से सटे चैनलों के भाग के लिए वर्तमान के चालन को रोकने के जो द्रव इलेक्ट्रोड चैनलों में फंस बुलबुले को उत्पन्न किया जा सकता है. अस्थिर प्रवाह एक पर्याप्त समय के लिए वैक्यूम के अंतर्गत डिवाइस नहीं रख या जल्दी होने के कारण खराब बंधुआ PDMS की delamination को वैक्यूम, रिसाव से हटाने पर डिवाइस नहीं भरने से उत्पन्न बुलबुले, सिरिंज या इनलेट ट्यूबिंग में फंसे एक बुलबुला की वजह से हो सकता है पंप परिचालन सीमा के चरम पर चैनलों को भरने, या प्रवाह की दर जब गिलास स्लाइड की वजह से अत्यधिक बल के लिए बाधा झिल्ली में आँसू डाला. कोशिकाओं के अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति निर्धारित करने के अलावा, इस तकनीक मोसे एल कोशिकाओं और मोतियों का एक मिश्रण द्वारा यहाँ सचित्र एक मिश्रण, सॉर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस उदाहरण मोसे एल कोशिकाओं सकारात्मक dielectrophoresis (pDEP) का अनुभव जहां आवृत्तियों पर 4 माइक्रोन मोती द्वारा प्रदर्शित नकारात्मक dielectrophoresis (nDEP) का लाभ लेता है. हम ओ200 वी आरएमएस और 10 kHz (6a चित्रा) पर डिवाइस perated और वे nDEP अनुभवी के रूप में कोशिकाओं और मोती दोनों मिलाया गया कि मनाया. मोती दो घटकों (चित्रा 6B) में मिश्रण की जुदाई को सक्षम करने, चैनल के निचले हिस्से तक ही सीमित थे, जबकि 50 kHz पर हम चैनल के शीर्ष पर मोसे एल कोशिकाओं के आंदोलन को मनाया. <img alt="चित्रा 5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> चित्रा 5. मोसे एल कोशिकाओं की स्थिति आवेदन बिजली क्षेत्र की आवृत्ति बदलने से छेड़छाड़ है. तस्वीरें नमूना चैनल में अंतिम sawtooth सुविधा पर लिया जाता है और fluidic इलेक्ट्रोड सही पक्ष पर कोनों में स्थित हैं. वे पीबीएस चैनल कल्पना करने fluoresces जो rhodamine बी, जिसमें से भर रहे हैं. (एक) मोसे एल कोशिकाओं 200 वी आरएमएस में nDEP अनुभव<html> और 5 kHz. (ख) मोसे एल कोशिकाओं 200 वी आरएमएस और 60 kHz पर मोती श्रृंखलन और pDEP अनुभव. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> . <img alt="चित्रा 6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> चित्रा 6. मोसे एल कोशिकाओं (हरा) और 4 माइक्रोन मोती (लाल) के एक मिश्रण 200 वी पर (एक). एक कम आवृत्ति cDEP डिवाइस का नमूना चैनल में अंतिम sawtooth सुविधा के माध्यम से प्रवाह और 10 kHz कोशिकाओं और मोती मिश्रित कर रहे हैं. तीर 200 वी पर (ख). थोड़े बल की संभावना की वजह से कम आवृत्ति शर्तों को मृत्यु हो गई है कि कोशिकाओं में दिखने के लिए बिंदु और 50 kHz कोशिकाओं pDEP अनुभव और चैनल की सुविधा किनारे करने के लिए कदम, मोती nDEP का अनुभव करते हुए और इस क्षेत्र के नजदीक तक ही सीमित रहते हैं सीधे धार.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;लक्ष्य =&quot; _blank &quot;&gt; बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Contactless dielectrophoresis (cDEP) उनके आंतरिक ढांकता हुआ गुण के माध्यम से छंटाई और कणों के संवर्धन को प्राप्त होता है. Fluidic इलेक्ट्रोड चैनलों बाँझ लक्षण वर्णन गैर हानिकारक और जैविक कणों की छंटाई के लिए cDEP suiting, रवानगी के लिए पारंपरिक धातु इलेक्ट्रोड जगह. हम एक cDEP microdevice तैयार करने और सेल लक्षण वर्णन और छँटाई प्रयोगों का संचालन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.

Contactless dielectrophoresis के माध्यम से लेबल मुक्त अलगाव और कोशिकाओं के संवर्धन

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

मानव दंत लुगदी स्टेम सेल के अलगाव विशेषता, और तुलनात्मक भेदभाव दो अलग अलग तरीकों का उपयोग करके स्थायी दांत से व्युत्पन्न

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

मानव कोशिका लाइनों से Chemoresistant डिम्बग्रंथि के कैंसर स्टेम सेल के लिए संवर्धन

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

अलगाव, cryopreservation और संस्कृति नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए मानव भ्रूणावरण उपकला कोशिकाओं

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

डिम्बग्रंथि के कैंसर के ट्यूमर शुरुआत कोशिकाओं की इन विट्रो संवर्धन में

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

मल्टी पैरामीटर प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा मानव लिम्फेटिक endothelial कोशिकाओं का अलगाव

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

अग्नाशय के कैंसर नई उपचार रणनीतियों के विकास के लिए सेल के लक्षण स्टेम का अध्ययन

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

एक माउस कर्क मॉडल से परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव और प्रचार

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

ट्यूमर विशिष्ट endothelial कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के विस्तार

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

लुकिंग ग्लास के माध्यम से: समय चूक माइक्रोस्कोपी और एकल कक्षों के अनुदैर्ध्य अध्ययन करने के लिए ट्रैकिंग विरोधी कैंसर चिकित्सा

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Minipigs की श्लेष द्रव और अस्थि मज्जा से व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल के अलगाव और सेलुलर phenotyping

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...