Name: matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometric analysis of intact proteins larger than 100 kda
Uploaded: 2013-09-09T13:00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa at JoVE.com

نشكر الدكتور كريستوف ماسيلون (iRTV، CEA، غرونوبل) وأعضاء من العدوى الفيروسية والسرطان في المجموعة IBS، لتقييم الحرجة للمخطوطة والمناقشات المفيدة. نحن ممتنون لسيريل ديان للهدية نوع من البروتين Crm1. استغرق هذا العمل العلمي مكان في منشأة قياس الطيف الكتلي لمركز التعليمات لغرونوبل (ISBG؛ UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). وأيد ماليا من قبل البنية التحتية للمبادرة الفرنسية الأحياء الهيكلية المتكاملة (FRISBI، ANR-10-INSB-05-02)، GRAL (ANR-10-LABX-49-01) [ضمن الشراكة غرونوبل لعلم الأحياء الهيكلي] و المركز الفرنسي الوطني للبحوث العلمية (CNRS).

1. إعداد البروتين العينة: العازلة صرف (اختياري) 5-25 ميكرولتر من تركيزات مكرومولي من البروتين (1-20 ميكرون) ضرورية. يمكن أن يتم تبادل عازلة خارج باستخدام أجهزة الطرد المركزي الفائق (مثل Vivaspin، سارتوريوس) أو الأعمدة ميكروسنتريفوج هلام الترشيح (على سبيل المثال، مايكرو بيو سبين 6 أعمدة اللوني، بيو راد) 29،30. خطوات تبادل العازلة يمكن تكرار 2-3X. وقدم وصفا تفصيليا الصرف العازلة سابقا 29،30. على سبيل المثال، نحن نستخدم 20 ملي تريس (هيدروكسي) aminomethane (أي تريس) الرقم الهيدروجيني 8 كما عازلة النهائي. ملاحظة: يمكن حذف هذه الخطوة في العديد من الحالات. ينبغي القيام بها عندما يحتوي عينة البروتين جزيئات أو المخازن المؤقتة التي يمكن أن تتداخل بقوة مع MS كشف [مثل الجلسرين، 4 - (2-هيدروكسي)-1-piperazineethanesulfonic حمض، HEPES]. كما أنها مفيدة لتحسين تشوعلى ality من الأطياف. 2. التبلور من مصفوفات من أجل تحسين تلك الطهارة (اختياري) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 10 مل من 40٪ من الإيثانول (ETOH) في قارورة بيركس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 ملغ من مصفوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حمام مائي وسخان المقاومة، تدفئة حل المصفوفة ويحرك حتى يذوب تماما المصفوفة باستخدام قضيب الزجاج أو النمام المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2 حتى يكون لديك محلول مشبع. </li></ol> ملاحظة: استخدام كمية كبيرة جدا من المذيبات أو تذويب سوف المصفوفة أقل بكثير من درجة غليان المحلول يسبب الغلة الفقراء من بلورات بلورات أو لا على الإطلاق. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح الحل لتبرد ببطء. يمكنك ترك في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات ومن ثم في 4 درجات مئوية خلال الليل. ملاحظة: إذا لم تتشكل البلورات، وتبلور يمكن الناجم عن الخدش داخل الدورق (فقط تحت سطح الحل) باستخدام قضيب الزجاج التحريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع بلورات المصفوفة عن طريق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بلورات مع الحد الأدنى من المذيبات الجليد الباردة والترشيح لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للبلورات لتجف. يمكنك استخدام فراغ لهذه الخطوة. </li></ol> 3. تنظيف الفولاذ المقاوم للصدأ الهدف MALDI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف لوحة MALDI مع الميثانول (MeOH) ويمسح برفق بمنديل التنظيف صنعت خصيصا لتطبيقات المختبر (مثل Kimwipe). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الهدف مع H 2 O وامسحه بمنديل التنظيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج لوحة MALDI في كوب 600 مل وتغطية ذلك مع 50٪ ETOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الهدف في حل ETOH لمدة 10 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان هناك بقايا المتبقية على لوحة، وكرر الخطوات 1-4 مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، شطف الهدف مع MeOH (أو مع الماء، انظر الملاحظة أدناه)، والميل هو في الطريقة التي يتم جمع كل السائل على الأنسجة التنظيف. السماح للهدف الجافة في درجة حرارة الغرفة أو استخدام النيتروجينتدفق الغاز. </li></ol> ملاحظة: تم وصف إجراء مماثل سابقا 15. ملاحظة: المذيب (MeOH أو الماء) المستخدمة في الشطف الأخير من الهدف يحدد بعض الميزات الهدف. إذا تم تشطف الهدف مع MeOH، ينتشر العينة على الهدف أكثر بكثير من عند استخدام المياه. 4. α-CHCA رقيقة طبقة الحل: إعداد وترسب على MALDI الهدف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل α-CHCA في الأسيتون من أجل جعل محلول مشبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من جهة (دون أي ماصة) تراجع 10 ميكرولتر طرف (مثل GELoader تلميح، إيبندورف) في α-CHCA محلول مشبع: سوف كمية صغيرة من الحل تتدفق في الطرف (بسبب الشعرية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلمس بسرعة كبيرة (أي 1 ثانية) الهدف MALDI مع طرف ماصة وإيداع الحل الأسيتون α-CHCA على الهدف MALDI. وهذا يشكل طبقة رقيقة مصفوفة، حيث البروتينوسوف تودع العينة. محاولة إنشاء طبقة رقيقة بقعة صغيرة قدر الإمكان. </li></ol> ملاحظة: عند استخدام SA مثل المصفوفة، ونحن نستعد طبقة رقيقة باستخدام محلول مشبع من SA في الأسيتون. 5. إعداد Natrix الحلول: SA، α-CHCA، DHB وCHCA_DHB خليط 25 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل 20 ملغ / مل SA في ACN، 0.1٪ TFA (70:30، المجلد / المجلد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 20 ملغ / مل α-CHCA الحل في ACN وحمض الفورميك 5٪ (70:30، المجلد / المجلد) [يدعى &quot;حل α-CHCA&quot;]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 20 ملغ / مل حل DHB في ACN وحمض 0.1٪ trifluoroacetic (TFA) (70:30، المجلد / المجلد) [يدعى &quot;حل DHB&quot;]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج &quot;حل α-CHCA&quot; و &quot;حل DHB&quot; في نسبة 1:1 (المجلد / المجلد)، للحصول على &quot;حل CHCA_DHB&quot;. </li></ol> ملاحظة: يمكن للمرء أن خلط &quot;α-CHCA الحل&quot; و &quot;حل DHB&quot; في نسب مختلفة، عند تحليل البروتينات مع كتلة أقل من 100 كيلو دالتون. لإكساءmple نسبة 40:60 بين α-CHCA وDHB (المجلد / المجلد) تعطي أفضل قرار، ولكن أقل حساسية (انظر المناقشة). 6. ترسب العينة على الهدف MALDI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع 0.5 ميكرولتر من العينة البروتين على α-CHCA طبقة رقيقة معدة مسبقا. مباشرة بعد ذلك، إضافة 0.5 ميكرولتر من الحل المصفوفة (أي SA حل أو الحل α-CHCA أو &quot;مزيج CHCA_DHB&quot;). هذا يعني خلط العينة والمصفوفة على الهدف. </li></ol> ملاحظة: عادة واحدة تختلط العينة البروتين مع المصفوفة في نسبة 1:1. هذه النسبة هو أمر حاسم لنوعية جيدة من أطياف MALDI. إذا كنت ترغب في اختبار عينة تركيزات مختلفة، يمكنك استخدام محلول حمض ACN_formic (المذكورة أعلاه) لتخفيف العينة. ملاحظة: إذا كنت تفضل، يمكنك مزج العينة ومصفوفة في أنبوب ثم إيداع المختلطة &quot;sample_matrix المحاليلنشوئها &quot;على طبقة رقيقة. ملاحظة: نقترح عليك لاختبار عينة تركيزات مختلفة لتمييع العينة يسمح لك للحد من التدخل من الملوثات. لتخفيف العينة، يمكنك استخدام محلول حمض ACN_formic (المذكورة أعلاه) لتخفيف العينة. 7. Calibrant ترسب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع 0.5 ميكرولتر من معيار calibrant (على سبيل المثال &quot;البروتين القياسية II&quot;، بروكر Daltonics، بريمن) ثم إضافة 0.5 ميكرولتر من الحل المصفوفة. </li></ol> ملاحظة: قم بتحميل calibrant على لوحة MALDI بجانب عينة البقع البروتين (انظر المناقشة). 8. MALDI أطياف اقتناء Calibrant وعينات البروتين مرة واحدة يتم تجفيفها العينات وcalibrant، يمكنك مراقبة &quot;النقاط&quot; تحت المجهر. هذه الملاحظة هو اختياري ويمكن أن تكون مثيرة للاهتمام أساسا إلى المبتدئين. للحصول على عينة الأطياف، إدراج الهدف ه في الصك MALDI-TOF واختيار المعلمات دور فعال المناسبة التي هي مختلفة لكل نوع من المعدات. للحصول على أنسب مجموعة المتابعة ينبغي للمرء أن اتباع توصيات الشركة المصنعة. كما الاعتبارات العامة عند تحليل البروتينات سليمة، ينبغي للمرء أن استخدام الصك في وضع خطي (وليس في وضع العاكس، الذي هو مناسبة لالببتيدات يحلل). عادة نستخدم أداة لدينا في وضع إيجابي أيون. علاوة على ذلك، معلمة المفتاح هو &quot;استخراج أيون نابض&quot; مما يحسن من القرار 31 دورا. بعبارات بسيطة، فإن &quot;أيون استخراج نابض&quot; يمكن تعريفها بأنها وقفة بين جيل من العينة الأيونات والوقت الذي تسارع الأيونات نحو كاشف. عند تحليل البروتينات سليمة، ينبغي للمرء أن تستغل &quot;استخراج أيون نابض&quot; (على سبيل المثال 500 NSEC) أكبر من عند مراقبة الببتيدات (على سبيل المثال 80 NSEC). اختيار مجموعة م / ض المناسبة، والحصول على أطياف سو في calibrant، ومعايرة أجهزة القياس. عند الحصول على أطياف العينات الخاصة بك، استخدم كثافة الليزر المناسب (انظر المناقشة).

<ol>
	<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Cohen, S. L., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+tool+for+protein+crystallography.">Mass spectrometry as a tool for protein crystallography.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry--a+useful+tool+for+the+protein+X-ray+crystallographer+and+NMR+spectroscopist.">Mass spectrometry--a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist.</a> Structure. 2, 465-467 (1994).</li><li>Gans, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+isotopic+labeling+of+methyl+groups+for+NMR+spectroscopic+studies+of+high-molecular-weight+proteins.">Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).</li><li>Wilm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+electrospray+ionization.">Principles of electrospray ionization.</a> Molecular &amp; cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407 (2011).</li><li>Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-plate:+extending+the+functionality+of+MALDI-MS+and+LDI-MS+targets.">Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets.</a> Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).</li><li>De Hoffmann, E., Stroobant, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry: Principles and Applications. , (2007).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).</li><li>Spengler, B., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+of+proteins+above+100,000+daltons+by+pulsed+ion+extraction+time-of-flight+analysis.">Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis.</a> Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+molecular+mass+determination+of+proteins+using+matrix-assisted+laser+desorption+mass+spectrometry.">High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry.</a> Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).</li><li>Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+of+biopolymers.">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers.</a> Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass-spectrometry+of+proteins.">Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins.</a> Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).</li><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+increase+contaminant+tolerance+in+protein+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+by+the+fabrication+of+thin+protein-doped+polycrystalline+films.">A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li><li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+detergent-friendly+method+for+mass+spectrometric+analysis+of+integral+membrane+proteins.">A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins.</a> Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li><li>Fenyo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+sample+preparation:+the+ultra+thin+layer+method.">MALDI sample preparation: the ultra thin layer method.</a> J. Vis. Exp.. (3), e192 (2007).</li><li>Gabant, G., Cadene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+full-length+integral+membrane+proteins+to+define+functionally+relevant+structural+features.">Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features.</a> Methods. 46, 54-61 (2008).</li><li>Hook, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains.">Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).</li><li>Vorm, O., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+sequence+information+derived+by+partial+acid+hydrolysis+and+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry.">Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cinnamic+acid+derivatives+as+matrices+for+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+proteins.">Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).</li><li>Madler, S., Boeri Erba, ., E, R., Zenobi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+Studying+Noncovalent+Complexes+of+Biomolecules.">MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules.</a> Topics in current chemistry. , (2012).</li><li>Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+first+shot+phenomenon+in+MALDI+mass+spectrometry+of+protein+complexes.">Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes.</a> The Analyst. 132, 199-207 (2007).</li><li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-assisted+Laser+Desorption+Mass+Spectrometry.">Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry.</a> Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).</li><li>Liu, Z., Schey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+MALDI+TOF-TOF+mass+spectrometer+for+intact+protein+analysis.">Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).</li><li>Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphite+supported+preparation+(GSP)+of+alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+(CHCA)+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+(MALDI-MS)+for+peptides+and+proteins.">Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).</li><li>Laugesen, S., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+two+matrices+results+in+improved+performance+of+MALDI+MS+for+peptide+mass+mapping+and+protein+analysis.">Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).</li><li>Sparkman, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Desk Reference. , (2000).</li><li>Kussmann, M., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+techniques+for+peptides+and+proteins+analyzed+by+MALDI-MS.">Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS.</a> Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).</li><li>Wang, R., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+mass+measurement+as+a+tool+for+studying+proteins.">High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins.</a> Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).</li><li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry.">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (40), e1954 (2010).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nature protocols. 2, 715-726 (2007).</li><li>Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+extraction+matrix-assisted+laser+desorption+time-of-flight+massspectrometry.">Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).</li></ol>

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

قدمنا ​​بروتوكول التفاصيل للحصول على جودة عالية الأطياف كتلة من البروتينات سليمة كبيرة مع الأوزان الجزيئية أكبر من 100 كيلو دالتون، وذلك باستخدام أداة MALDI-TOF. وينبغي النظر في عدد من الجوانب الهامة المتعلقة بإعداد العينة بعناية من أجل تحسين نوعية الأطياف الشامل. المصفوفات والمذيبات عالية النقاء ذات أهمية حاسمة لأن تتركز كل الملوثات الموجودة في مصفوفات والمذيبات على الهدف MALDI بعد تبخر المذيبات. من أجل تعزيز نقاء المصفوفات MALDI فمن الممكن لتنقية لهم باستخدام الأساليب الكلاسيكية التبلور (انظر أعلاه). نوصي أيضا إلى إعداد طازجة الحلول المصفوفات (على الأقل مرة واحدة في الأسبوع) لتحسين بلورة المصفوفة وتجنب تدهور المصفوفة. النهج ترسب مصفوفة حرجة للغاية لنوعية النهائي للأطياف. كما هو موضح أعلاه، وطريقة طبقة رقيقة هو أسلوبنا سو خيار 12. وعلاوة على ذلك، ونحن الأمثل النهج لإيداع الطبقة الأولى. عندما يذوب في الأسيتون المصفوفة للحصول على محلول مشبع، وبروبانون يسمح التبخر السريع للالمذيب، ولكن أيضا يجعل حجم الطبقة الأولى من الصعب جدا السيطرة عليها. نقترح استخدام تلميح GELoader كما فرشاة القليل الذي تراجع في حل matrix_acetone للحصول على الحد الأدنى من حجم الذي تقوم بإيداع بسرعة على الهدف. حجم الطبقة الأولى تسيطر على نحو ما الحجم النهائي للبقعة MALDI: بقعة صغيرة (أي 0،5-،75 ملم من قطر) هو الأفضل لأنه في هذه الحالة تركيز العينة هو أعلى منه في حالة وجود بقعة كبيرة. الحصول على بقعة صغيرة يختلف عن النهج طبقة رقيقة جدا المقترحة سابقا في شريط فيديو JOVE 15. في Fenyo وآخرون. ينتشر الحل طبقة رقيقة في جميع أنحاء الهدف MALDI باستخدام الجانب من طرف ماصة. يتطلب هذا النهج اختبار طبقة رقيقة التي ينبغي أن تلبي معايير محددة(على سبيل المثال سرعة تبخر المذيبات). إذا لم يتم استيفاء المعيار، يجب غسلها الهدف MALDI وينبغي إعداد طبقة رقيقة جديدة. وهذا يجعل إعداد شاقة جدا بالنسبة لمبتدئ. وعلاوة على ذلك، فإن ترسب خليط عينة / مصفوفة على لوحة يتطلب تطلع المذيبات الزائد باستخدام خط فراغ وخطوة الغسيل باستخدام TFA 15 هو ضروري، مما يجعل Fenyo وآخرون. إعداد قليلا أكثر صعوبة من نهجنا. نسبة حجم المصفوفة وبين عينة من المهم جدا بالنسبة لتحليل ناجحة من البروتينات سليمة من قبل MALDI-TOF. بعد اختبار نسب مختلفة نقترح استخدام نسبة 1:1. مصفوفة مختلفة: عينة نسبة يمكن أن تؤثر سلبا على جودة الأطياف، وربما يرجع ذلك إلى تبلور غير متجانسة. الترتيب الذي يتم إيداع مصفوفة وعينة أمر بالغ الأهمية أيضا. بعد إيداع طبقة رقيقة مصفوفة، وتودع العينة ومباشرة بعد (قبل عصيدةلو يصبح بقعة جافة) يضاف خليط CHCA_DHB. وقد تم تعريف هذا الإجراء بأنه &quot;طريقة ساندويتش&quot; 27، حيث يتم إيداع عينة وحده بين طبقتين المصفوفة. كبديل، والحل CHCA_DHB والعينة يمكن أن تكون مختلطة في أنبوب 0.5 مل ثم رصدت على طبقة رقيقة CHCA 12. هذا ينتج بقعة مع طبقة متجانسة من البلورات الناتجة في ذات جودة عالية الأطياف. عند تحليل البروتينات مع انخفاض كتلة من 100 كيلو دالتون، وتركيز DHB يمكن زيادة (على سبيل المثال 60:40 DHB: CHCA)، وهذا يمكن أن تنتج أكثر وضوحا الذروة، ولكن يمكن أن تؤثر سلبا على حساسية قياس (أي قمم أقل كثافة). لمعايرة الأدوات الصحيحة، فمن الضروري أن تودع المعايير calibrant قريبة جدا من بقع عينة، مما يسمح احد للحصول على دقة أفضل الشامل. A &quot;الزائفة الداخلية إجراء المعايرة&quot; واقترح سابقا 15: بعد الحصول على عينة الطيف، بقعة ط calibrantتضاف ق الليزر اطلاق النار وإشارة من calibrant إلى الطيف العينة. هذا يسمح لك لمعايرة داخليا الطيف العينة باستخدام القمم calibrant. وينبغي أيضا التحكم في طاقة الليزر بعناية خلال اقتناء الأطياف. في معظم الحالات، والطاقة العالي يزيد من حساسية، ولكن يقلل من القرار. نقترح استخدام الحد الأدنى الممكن طاقة الليزر دون المساس حساسية الاستحواذ. وعلاوة على ذلك، من أجل تحسين جودة الطيفية، يمكن للمرء الحصول على مزيد من الطلقات على كل بقعة العينة. عادة مزيد من الطلقات تحصل عليه (1،000-2،000 طلقة)، وارتفاع كثافة الإشارة. عندما تصل إلى بقعة مع الليزر، ويحتاج المرء إلى العثور على المكان المناسب (أي &quot;بقعة الحلو&quot;)، لأنه لا يتم توزيع العينة متجانس. يمكنك اطلاق النار على نفس المنطقة حتى إشارة آخذ في الازدياد، ومن ثم محاولة إيجاد منطقة أخرى تحتوي على العينة. في الختام، نقاء عالية من المصفوفات ويذابالوالدان، والأساليب المستخدمة لعينة والمصفوفات ترسب على الهدف، والموقف من المعايير المستخدمة للمعايرة، وكثافة طاقة الليزر، والوقت من اقتناء (عدد من الطلقات / البقعة) هي العوامل الحاسمة التي ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار عند تحليل البروتينات سليمة من قبل MALDI-TOF MS. المؤلف مساهمات LS والنفقات الخارجة عن الميزانية تصميم التجارب، أجريت التجارب مطياف الكتلة، تحليل البيانات، وكتب مخطوطة.

يعتمد علم الأحياء الهيكلي على إنتاج البروتينات عالية الجودة (1) وبالتالي يحتاج إلى أن يقترن مع تقنيات فعالة وموثوقة لتحليل البروتين 2،3. لدينا في مطياف الكتلة (MS) داخل مختبر معهد البيولوجيا البنيوية نحن بحاجة لتأكيد تسلسل الأولية للبروتينات، وتقييم وجود الطفرات وتعديلات ما بعد النقل، وتدهور البروتينات، والتجانس العينة، ونوعية وضع العلامات النظائر (على سبيل المثال بالديوتيريوم البروتينات للدراسات الرنين المغناطيسي النووي 4). منذ الأحياء الهيكلية استخدام التحلل البروتيني محدودة للتمييز المجالات جامدة هيكليا من أجزاء مرنة، ونحن بحاجة لتوصيف موثوق مثل البروتينات اقتطاع باستخدام MS. عندما يتم تحليل الجزيئات الحيوية عن طريق MS، وتستخدم نهجين الممكن ionise بهدوء مثل هذه الجزيئات الثقيلة وعطوب. تأين Electrospray (ESI) ionises جزيئات مباشرة منيتطلب بمساعدة مصفوفة الامتزاز الليزر تأين (MALDI) أن الجزيئات الحيوية وشارك تبلورت مع الجزيئات العضوية التي تمتص الأشعة فوق البنفسجية (أي مصفوفة الجزيئات) 6؛ الطور السائل 5. إلى جانب ESI الوقت من الطيران (TOF) MS إلى اللوني السائل أصبحت تقنية روتينية لتحليل البروتينات سليمة، لأنه يسمح التصميم الشامل مع دقة عالية (≤ 50 جزء في المليون). ومع ذلك، فإنه هو عرضة للغاية لتكوين عينة العازلة (وخاصة للأملاح والمنظفات الصناعية) والملوثات (أي بوليمرات) والتي تكون في بعض الأحيان صعبة للقضاء، مما تسبب في قمع إشارة الحليلة. MALDI-TOF MS يمثل بديلا فعالا للESI-MS بسبب أدائها هو أقل تأثرا مكونات العازلة، المنظفات والملوثات، ويسمح البروتين سليمة تقرير الشامل مع دقة كافية (≤ 500 جزء في المليون) للتحقق من صحة التسلسل. بعد البروتيناتن الهضم، ويمكن استخدامها MALDI-TOF MS أيضا لتحليل الببتيدات التي تم الحصول عليها لمزيد من التأكيد تسلسل الأولية من قبل ما يسمى ب &quot;الببتيد البصمات الشامل&quot;. في أيدينا، وتحديد كتلة من البروتينات سليمة، والتي هي أكبر من 100 كيلو دالتون وغير المتجانسة (بسبب التعديلات أو truncations)، هو أسهل من خلال MALDI-MS من قبل ESI-MS. ويرجع ذلك إلى عدم وجود تداخل التوزيعات ولاية تهمة موجودة في ESI أطياف هذا. علاوة على ذلك، منذ عملية MALDI لا تعتمد على حجم الحليلة 7، مثل عوائد طريقة حساسية عالية عندما كتلة جزيء حيوي هو فوق 100 كيلو دالتون. أجريت تحليلات رائعة من البروتينات سليمة من استخدام الأدوات المصنوعة محليا بين نهاية عام 1980 وبداية عام 1990 في 8-11. MALDI-TOF يمكن استخدامها أيضا كأداة فحص لتقييم جودة عينات البروتين لأنه يتطلب وقتا أقل لإعداد العينات وأقل عرضة للinterferenالمجال الاقتصادي الموحد بسبب الشوائب المشتركة (مثل أملاح). بعد الأولى، والتقييم السريع من قبل MALDI-MS، عينة يمكن تحليلها بواسطة ESI-TOF لتحديد كتلته مع دقة أعلى. علاوة على ذلك، MALDI بتوليد أيونات تحتوي على رسوم أقل من ESI، وبالتالي اكتساب وتفسير البيانات MALDI هو أكثر وضوحا. هذا يتيح للطلاب العمل في علم الأحياء الهيكلي لتحليل البروتينات المؤتلف بهم فقط بعد تدريبي قصير الامد. نوعان من العوامل الرئيسية التأثير على نوعية أطياف MALDI: المصفوفة والتقنية المستخدمة لترسب مصفوفة (الحبرية مثل المجففة 8 و طبقة رقيقة 12-16،17،18). مصفوفة العضوية احدة [مثل حمض sinapinic (SA) 19-21 أو α-سيانو-4-hydroxycinnamic حمض (α-CHCA) 14،22،23] وغالبا ما يستخدم لفحص MS البروتينات سليمة والمجمعات البروتين عبر ربط . باستخدام α-CHCA، قدم مجموعة Chait سابقا بروتوكول مفصلة لعيصلح طبقة رقيقة جدا قبل تحليل MALDI من البروتينات القابلة للذوبان وغشاء 14،15. في الآونة الأخيرة، جوركا آخرون يتضح طلاء الهدف القائم على الجرافيت لتحسين تحليل MALDI من الببتيدات والبروتينات باستخدام α-CHCA مثل المصفوفة 24. هنا، نقدم بروتوكول بسيط لتحليل البروتينات سليمة من قبل MALDI-TOF MS، وذلك باستخدام مزيج من اثنين من المصفوفات: حمض 2،5-dihydroxybenzoic (DHB) وα-CHCA 25. قمنا بتقييم منهجي لأداء مزيج DHB-CHCA مقارنة SA-α وCHCA المصفوفات، من أجل السيطرة على البروتينات سليمة. خليط مصفوفة يسمح قرار أفضل (أي قمم البروتين هي أكثر وضوحا من ذلك بكثير). وعلاوة على ذلك، فإن وجود مكثفة تهم متعددة الأيونات (أي M +2 H 2 +، M +3 H 3 +، الخ) تمكن تقرير الشامل أكثر دقة لأن القرار من الصكوك المحوري MALDI-TOF أعلى في انخفاض الشامل أكثر من تهمة (م / ض) 26. هذا مفيد بشكل خاص لتحديد الوزن الجزيئي للبروتينات أكبر من 100 كيلو دالتون. يتم التوصل إلى حساسية أعلى أيضا باستخدام خليط DHB-CHCA (0.5 pmoles من البروتين رصدت على الهدف MALDI). كما ذكرنا أعلاه، أحد العوامل الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار عند استخدام أداة MALDI هو ترسب مصفوفة. وجسن وآخرون. اقترح استخدام DHB-CHCA الخليط لأول مرة 25، وذلك باستخدام ترسب قطرات المجففة. ومع ذلك، لاحظنا نتائج أفضل (مثل حساسية أعلى من ذلك بكثير) عندما كنا تستخدم أسلوب طبقة رقيقة حيث يتم تشكيل الطبقة الأولى من α-CHCA المذاب في الأسيتون. طبقة رقيقة الأسلوب 12،27 يعني تشكيل قوام متجانس من بلورات المصفوفة على الهدف MALDI، التي وصفت في شريط فيديو إن الرب سابقا 15. ثم، وتودع العينة على هذه التحتية، وأخيراوتودع مصفوفة إضافية (انظر أدناه). في هذه المقالة، ونحن أيضا توضيح كيفية إيداع العينة على الهدف MALDI، ولكن أيضا كيفية تنظيف الهدف 15، لأعد بلورة وإعداد مصفوفات. لإبرام نحن نهدف إلى توفير جميع المعلومات اللازمة لتحليل البروتينات سليمة للعلماء (على وجه الخصوص، وعلماء الأحياء الهيكلية) الذين يحتاجون إلى تقييم نوعية البروتينات التي تنتج في وسيلة سريعة وبسيطة والذين ليسوا على دراية بذلك مع MALDI-TOF MS. كما تنبأ في منتصف 1990s 28، زارها MS تأثير زيادة على البحوث البيولوجية، وإمكانية الحصول عليها لعلماء البيولوجيا قد ازداد. نأمل أن المعلومات التي قدمت وسوف يكون من المفيد لجعل MALDI-TOF في متناول علماء البيولوجيا وعلماء الذين يرغبون في بدء استخدام مطياف الكتلة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizima</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin 6 chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0122</td>
			<td>various molecular weight cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>02860</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>05511</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>39319</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 001.222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09676</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Standard II</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>207234</td>
			<td>It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoglobulin G</td>
			<td>ABSciex</td>
			<td>GEN602151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier PURELAB Ultra Analytic</td>
			<td>ELGA LabWater</td>
			<td>89204-052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometric analysis of intact proteins larger than 100 kda

تحديد فعالية الجماهير من البروتينات أمر بالغ الأهمية لكثير من الدراسات البيولوجية (مثلا للتحقيقات البيولوجيا البنيوية). تقرير شامل دقيق يسمح احد لتقييم صحة تسلسل الأولية البروتين، وجود الطفرات و / أو التعديلات بعد متعدية، وتدهور ممكن البروتين، والتجانس العينة، ودرجة النظائر التأسيس في حالة وضع العلامات (مثل وضع العلامات 13 C ). يستخدم Electrospray تأين (ESI) مطياف الكتلة (MS) على نطاق واسع لتحديد كتلة من البروتينات التشويه والتحريف، ولكن يتأثر كفاءتها من خلال تكوين عينة العازلة. على وجه الخصوص، وجود الأملاح والمنظفات، والملوثات يقوض بشدة فعالية تحليل البروتين بواسطة ESI-MS. بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين (MALDI) MS هو بديلا جذابا، وذلك بسبب التسامح الملح وبساطة الحصول على البيانات وتفسيرانشوئها. وعلاوة على ذلك، فإن تحديد كتلة غير متجانسة من البروتينات الكبيرة (أكبر من 100 كيلو دالتون) هو أسهل عن طريق MALDI-MS نظرا لعدم وجود تداخل التوزيعات ولاية تهمة عالية والتي هي موجودة في ESI الأطياف. هنا نقدم هذا النهج للوصول لتحليل البروتينات أكبر من 100 كيلو دالتون بواسطة MALDI وقت الرحلة (TOF). نحن لتوضيح مزايا استخدام مزيج من اثنين من المصفوفات (حمض أي 2،5-dihydroxybenzoic وحمض α-سيانو-4-hydroxycinnamic) والأداة المساعدة للأسلوب طبقة رقيقة مع اقتراب لترسب العينة. نحن أيضا مناقشة الدور الحاسم للمصفوفة والنقاء المذيبات، المعايير المستخدمة في المعايرة، من طاقة الليزر، وللاكتساب الوقت. عموما، ونحن نقدم المعلومات اللازمة لمبتدئ لتحليل البروتينات سليمة أكبر من 100 كيلو دالتون بواسطة MALDI-MS.

قمنا بتحليل البروتين سليمة (صيانة المنطقة كروموسوم 1 البروتين، Crm1؛ الوزن الجزيئي: 123386 دا) باستخدام اثنين من المصفوفات مختلفة، طريقتين الترسيب، ونفس كثافة الليزر (الشكل 1). واستخدمت SA وخليط CHCA_DHB كما المصفوفات. خليط أسفرت أطياف الشامل من أعلى جودة من حيث إشارة إلى نسبة الضوضاء والحساسية (أرقام 1A وباء). على وجه الخصوص، فإننا لا يمكن الكشف عن 0.5 pmoles من البروتين المودعة على الهدف MALDI (الشكل 1C). وكان نفس كمية البروتين بالكاد يمكن كشفها باستخدام SA (1D الشكل). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام خليط المصفوفات، كان الأسلوب المفضل لترسب مصفوفة نهج &quot;طبقة رقيقة&quot; (الشكل 1A). باستخدام طريقة &quot;المجفف الحبرية&quot;، ونحن لم يكشف أي بروتين مع كتلة أعلى من 100 كيلو دالتون (لا تظهر البيانات). الاستفادة من خليط CHCA_DHB (أرقام 1A و 1C)، اتهم تتكاثر أيون من البروتيناتن لوحظت، مما يتيح للتقرير الشامل مع أعلى قدر من الدقة لأن القرار ذروة في الصكوك MALDI-TOF محوري يتناسب عكسيا مع م / ض 26. نحن أيضا تحليل أحادى بيتا غالاكتوزيداز (116300 دا) (الشكل 2). وكانت الأطياف CHCA_DHB أفضل من SA أطياف من حيث الحساسية والدقة. وعلاوة على ذلك، فإن وجود أيونات مشحونة ضرب (م 2 +، 3 + M و M 4 +) سمح لنا لتأكيد كتلة البروتين مع دقة أعلى (أرقام 2A و 2C). باستخدام نهج طبقة رقيقة، قارنا أداء الخليط CHCA_DHB، SA-α وCHCA وحدها لتحليل والمناعي، مفتش (148500 دا) (الشكل 3). عندما كنا ربط بيانات مختلفة، وكانت إشارات البروتين العالي ومع أفضل قرار في أطياف CHCA_DHB. وختاما، فإن استخدام الخليط CHCA_DHB ورقيقة طريقة ترسيب طبقة<html> أظهرت تحسنا كبيرا في نوعية كبيرة سليمة أطياف البروتين الشامل المكتسبة باستخدام أداة MALDI TOF. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" /> الشكل 1. تحليل MALDI-TOF المنطقة كروموسوم سليمة الصيانة 1 البروتين، (Crm1)، الوزن الجزيئي: 123386 دا. تم تحليل A) 1 pmole من Crm1 باستخدام مزيج DHB_CHCA مثل المصفوفة B) كمية: 1 pmole؛ مصفوفة: SA C) كمية: 0.5 pmole؛ مصفوفة: DHB_CHCA D) كمية: 0.5 pmole؛ مصفوفة: SA. إشارة من القمم، وأعرب في نطاق وحدة كثافة التعسفي، هو تطبيع إلى أقصى قيمة الحاضر في كل الطيف. خريج &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. تحليل MALDI-TOF من سليمة بيتا غالاكتوزيداز (116300 دا). أ) كمية: 20 pmoles؛ مصفوفة DHB_CHCA B) كمية: 20 pmoles؛ مصفوفة: SA C) كمية: 5 pmoles؛ مصفوفة: DHB_CHCA D) كمية: 5 pmoles؛ مصفوفة: SA. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" /> الرقم 3. تحليل MALDI-TOF من الغلوبولين المناعي سليمة، مفتش (148،500 دا)؛ المبلغ: كانت 1.7 pmoles الأطياف التي تم الحصول عليها باستخدام خليط CHCA_DHB أكثر كثافة بكثير (الحد الأقصى: 8200 وحدة تعسفية، والاتحاد الافريقي) من أطياف SA (الحد الأقصى: 1،200 [أو]) وα-CHCA الأطياف (الحد الأقصى: 4500 الاتحاد الافريقي)

Watch this Scientific Journal Video about Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa at JoVE.com

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

يمثل قياس كتلة دقيقة خطوة هامة أثناء التحقيق في البروتينات. بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين (MALDI) مطياف الكتلة (MS) يمكن استخدامها لمثل هذا القرار والميزة الرئيسية له هو التسامح إلى الأملاح والمنظفات والملوثات. نحن هنا توضيح نهج الوصول إليها لتحليل البروتينات أكبر من 100 كيلو دالتون بواسطة MALDI-MS.

بمساعدة مصفوفة الليزر الامتزاز / التأين وقت الرحلة (MALDI-TOF) قداس التحليل الطيفي من البروتينات سليمة أكبر من 100 كيلو دالتون

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

التنميط محتويات Triacylglyceride في بات غلافي الدهون بواسطة التحليل اللوني طبقة رقيقة محضرة وMALDI-TOF الطيف الكتلي

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

كتلة الطيفية المداخل لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في مساحيق المجففة بالتبريد

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

سريع سرعة عالية الإنتاجية الأنواع النباتية تحديد المواد عن طريق تحليل المباشر في الوقت الحقيقي عالية الدقة قياس الطيف الكتلي

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

تحليل التنفس في الوقت الحقيقي باستخدام التأين نانوليكتروسبراي الثانوية بالإضافة إلى دقة عالية الطيف الكتلي

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

توصيف البوليمرات الاصطناعية عن طريق مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين وقت الرحلة (استخدام-TOF) الطيف الكتلي

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

أسلوب إعداد نموذج فعال لتعزيز الإشارات أيون الكربوهيدرات في مصفوفة-بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين الكتلي

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

التصوير التاكل في واجهه الطلاء المعدني باستخدام مقياس الطيف الطيفي الثانوي لأيونات الطيران

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

طريقه التحلل اللوني للغاز بخطوتين مع الكشف الطيفي الشامل لتحديد مكونات حبر الوشم والمنتجات المزيفة

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

تحليل الجزيئات المعقدة وردود أفعالها على الأسطح عن طريق الامتصاص/التأيّن الطيفي الكتلي الناجم عن الكتلة

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

تحديد بروتينات المناعة المضادة للبكتيريا في الإشريكية القولونية باستخدام MALDI-TOF-TOF-MS/MS والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...