Name: matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometric analysis of intact proteins larger than 100 kda
Uploaded: 2013-09-09T13:00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa at JoVE.com

私たちは、原稿の彼らの重要な評価のために有用な議論のために、IBS博士クリストフMasselon（IRTV、CEA、グルノーブル）やウイルス感染のメンバーとがんグループに感謝します。我々は、タンパク質CRM1の種類のギフトのためのシリル·ディアンに感謝しています。この科学的な仕事は、グルノーブルに指示センター（; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL ISBG）の質量分析施設で行われた。これは、財政的に統合された構造生物学イニシアティブ（FRISBI、ANR-10-INSB-05から02）のためのフランスのインフラストラクチャによってサポートされていました、GRAL（ANR-10-LABX-49-01）[グルノーブルパートナーシップ内の構造生物学]とすることにより科学研究のためのフランス国立センター（CNRS）。

1。タンパク質サンプル調整：バッファー交換（オプション） タンパク質のマイクロモル濃度（1から20μm）で5月25日μLが必要です。緩衝液交換は、29,30、遠心限外濾過装置（ 例えばビバスピン、ザルトリウス）または微量遠心ゲル濾過カラム（ 例えば 、マイクロバイオスピン6クロマトグラフィーカラム、Bio-Rad）を用いて行うことができる。バッファー交換ステップは、2〜3倍を繰り返すことができる。緩衝液交換の詳細な説明は、以前に29,30を発表した。例えば、我々は最終的な緩衝液として20mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ すなわちトリス）は、pH 8を利用する。 注：このステップは、多くの場合、省略することができる。タンパク質試料を強くMS検出に干渉する可能性分子または緩衝剤が含まれている場合には、行われるべきである[ 例えばグリセロールと、4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 -ピペラジンエタンスルホン酸、HEPES]。それは、QUを向上させるためにも便利ですスペクトルのality。 2。それらの純度（オプション）を改善するために、行列の再結晶<ol><li>パイレックスフラスコに40％エタノール（EtOH）10ml中に注ぐ。 </li><li>行列の600ミリグラムを追加します。 </li><li>水浴と抵抗ヒーターを用いて、マトリックス溶液を加温し、マトリックスが完全にガラス棒または磁気スターラーを用いて溶解するまで攪拌する。 </li><li>あなたは飽和溶液になるまで、手順2を繰り返します。 </li></ol> 注意：溶剤をあまりに大量に使用したり、遠く溶液の沸点以下のマトリックスを溶解させて結晶又は全く結晶の歩留まりが悪いの原因となります。 <ol start="5"><li>溶液をゆっくりと冷却します。あなたは、数時間室温のままにし、次いで4℃で一晩できる。注：結晶が形成されていない場合は、結晶化ガラス攪拌棒を使用して、（ちょうど液面下）ビーカー内を引っ掻くことによって誘導することができる。 </li><li>濾過によりマトリックス結晶を収集します。 </li><li>氷のように冷たい溶媒の最小限の結晶を洗浄し、それらをろ過する。 </li><li>結晶を乾燥させる。このステップのために真空を使用することができます。 </li></ol> 3。 MALDIステンレス鋼ターゲットのクリーニング<ol><li>メタノール（MeOH）でMALDIプレートをすすぎ、特別に研究室のアプリケーション（ 例えばキムワイプ）のために作らクリーニングティッシュでやさしく拭きます。 </li><li> H 2 Oでターゲットをすすぎ、クリーニングティッシュで拭いてください。 </li><li> 600ミリリットルのビーカーにMALDIプレートを挿入し、50％エタノールでそれをカバーしています。 </li><li>超音波浴中で10分間EtOH溶液中の標的に超音波処理する。 </li><li>プレート上に残った残留物がある場合は、もう一度1から4の手順を繰り返します。 </li><li>最後に、すべての液体がクリーニングティッシュ上で収集された方法でそれを傾け、（または水で、下の注を参照）、MeOHでターゲットをすすぐ。室温での目標を乾燥させるか、使用して窒素、ガス流。 </li></ol> 注：同様の手順は、以前に15を説明した。 注意：ターゲットの最後のすすぎのために使用される溶媒（メタノールまたは水）は、いくつかのターゲットの特徴を決定します。標的をMeOHでリンスすると、サンプルは、水を使用した場合よりもはるかにターゲット上に広がる。 4。 α-CHCA薄層溶液：MALDIターゲット上の準備と堆積<ol><li>飽和溶液を作るためにアセトン中でα-CHCAを溶解する。 </li><li>手で（任意のピペットせずに）、α-CHCA飽和溶液中に10μlの先端（ 例えば GELoaderヒント、エッペンドルフ）を浸します。ソリューションを少量（毛細管現象により）先端に流れます。 </li><li>ピペットチップで非常に急速に（ つまり 1秒）、MALDIターゲットをタッチし、MALDIターゲット上のα-CHCAアセトン溶液を堆積させる。これは、マトリックスの薄層に、タンパク質を構成するサンプルが堆積される。可能な限り小さく薄層スポットを生成しよう。 </li></ol> 注意：マトリクスとしてのSAを使用する場合、我々はアセトン中のSAの飽和溶液を用いた薄層を作製。 5。ユウダ属溶液の調製：SA、α-CHCA、DHBとCHCA_DHB混合25 <ol><li> ACN中の20 mg / mlのSA溶液を調製し、0.1％TFA（70:30、体積/体積）。 </li><li> 20のACN mg / mlのα-CHCA溶液及び5％ギ酸[「α-CHCA溶液」という名前]（70:30、体積/体積）を準備します。 </li><li> ACN中20 mg / mlのDHB溶液と、[&quot;DHB液」と名付け] 0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）（70:30、体積/体積）を準備します。 </li><li> 「CHCA_DHB溶液」を得るために、1:1の比（体積/体積）の「α-CHCA溶液」及び「DHB溶液を「混合する。 </li></ol> 注：質量100kDa未満を有するタンパク質を分析する際に一つは、異なる比率で「α-CHCA溶液」と「DHBソリューション」を混在させることができます。 EXA用mpleα-CHCAとDHB（vol / vol）の間の40:60の比率がより高い分解能が、あまり感度が（議論を参照）が得られる。 6。 MALDI標的上のサンプル堆積<ol><li>先に調製したα-CHCA薄層上にタンパク質試料の寄託0.5μL。その直後に、マトリックス溶液（ すなわち 、SA液やα-CHCA溶液または「CHCA_DHBミックス」）の0.5μlを添加する。これは、ターゲット上に試料とマトリックスとを混合することを意味。 </li></ol> 注意：通常、一方が1:1の比率でマトリクスとタンパク質サンプルを混合する。この比率は、MALDIスペクトルの良質のために重要である。あなたは、異なるサンプル濃度をテストしたい場合は、サンプルを希釈する（前述）ACN_formic酸溶液を使用することができます。 注：必要に応じて、あなたは、チューブ内の試料とマトリックスを混合し、次いで混合」sample_matrixソリューションを堆積させることができます薄層上のTiON」。 注意：試料を希釈するとあなたは汚染物質の干渉を低減することを可能にするため、我々は、異なるサンプル濃度をテストすることをお勧めします。試料を希釈するためには、サンプルを希釈する（前述）ACN_formic酸溶液を使用することができます。 7。キャリ堆積<ol><li>預金キャリ基準の0.5μL（ 例えば 「タンパク質標準II」、ブルカーダルト、ブレーメン）をマトリックス溶液0.5μlを加える。 </li></ol> 注：（説明を参照）タンパク質試料スポットの隣にMALDIプレート上で較正をロードします。 8。キャリブラントのMALDIスペクトル取得とタンパク質サンプルサンプルおよびキャリブラントが乾燥したら、顕微鏡下で「スポット」を観察することができます。この観察結果は、オプションであり、主に初心者に興味深いものになることがあります。サンプルスペクトルを取得するために、目を挿入EのMALDI-TOF装置におけるターゲットや機器の種類ごとに異なっており、適切な機器パラメータを選択します。最も適切なセットアップを取得するには1を、製造業者の推奨に従ってください。インタクトタンパク質を分析する際の一般的な考慮事項として、1は（分析し、ペプチドに適していない、反射モードでは、）リニアモードで測定器を使用する必要があります。通常、我々は、正イオンモードで私たちの楽器を使用しています。また、キーパラメータは、楽器の分解能31を改善し「パルスイオン抽出」である。簡単に言えば、「パルスイオン抽出」とは、試料イオンの生成イオンが検出器に向かって加速される時間との間の休止として定義することができる。インタクトタンパク質を分析する場合、1ペプチドを観察するときよりも大きな「パルスイオン引き出し」（ 例えば 500ナノ秒）を利用しなければならない（ 例えば 80ナノ秒）。 適切なm / z範囲を選択して、スペクトルOを取得キャリ女、機器を校正。あなたのサンプルのスペクトルを取得した場合、（説明を参照）、適切なレーザー強度を使用しています。

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利害の対立が宣言されていません。

我々は、MALDI-TOF装置を使用して、100kDaのより大きな分子量を有する大規模な無傷のタンパク質の高品質の質量スペクトルを取得するためのプロトコルの詳細を提示した。試料調製に関する重要な側面の数が慎重にマススペクトルの質を改善するために考慮されるべきである。マトリックスおよび溶媒中に存在する全ての汚染物質は、溶媒蒸発後にMALDIターゲット上で濃縮されるため、高純度のマトリックスおよび溶媒は、非常に重要である。 MALDIマトリックスの純度を向上させるためには、古典的な再結晶化方法（上記参照）を使用して精製することが可能である。また、マトリックスの結晶化を改善し、マトリックス分解を避けるために（少なくとも週に一度）を新たに行列溶液を調製することをお勧めします。 マトリックス沈着アプローチはスペクトルの最終的な品質のために非常に重要です。上述したように、薄層法は、我々の手法であるoをFの選択12。また、我々は、第一​​の層を堆積するためのアプローチを最適化した。マトリックスは、飽和溶液を得るためにアセトンに溶解したとき、プロパノン、溶媒の急速蒸発を可能にするだけでなく、制御することは第一層のサイズが非常に困難にする。私たちは、あなたがすぐにターゲット上に堆積最小容積を得るためにmatrix_acetone溶液に浸して少しブラシとしてGELoaderチップを使用してお勧めします。第一の層のサイズは、何らかの形でMALDIスポットの最終サイズを制御し、この場合、試料濃度が大きいスポットの場合よりも高いので、小さいスポット（直径、すなわち 0.5〜0.75ミリメートル）が好ましい。小さ ​​なスポットを得ることは、以前にJOVEビデオ15で提案された超薄層のアプローチとは異なります。 Fenyo ら。薄層溶液をピペットチップの側面を使用して、すべてのMALDIターゲットに広がっている。このアプローチは、特定の基準を満たすべきである薄層をテストする必要があります（溶剤の蒸発などの速度）。基準が満たされない場合、MALDIターゲットを洗浄する必要があり、新たな薄い層が調製されるべきである。これは初心者のための準備は非常に骨の折れることができます。さらに、プレート上の試料/マトリックス混合物の堆積は、真空ラインを用いて過剰の溶媒の吸引を必要とし、TFA 15を用いて洗浄工程Fenyo らを作る必要がある。我々のアプローチよりも調製が少し難しく。 マトリックスと試料との間の体積比は、MALDI-TOFによってインタクトなタンパク質を正常に解析のために極めて重要である。異なる比率をテストした後、我々は1:1の比率を使用することをお勧めします。別のマトリックス：サンプル割合は、おそらく不均一結晶化、スペクトルの質が損なわれる可能性があります。マトリックスと試料が堆積される順序も重要である。マトリックスの薄層を堆積した後SAMP前に、サンプルが堆積され、直後に（ルスポット）を乾燥CHCA_DHBなる混合物を添加する。この手順は、単独で試料二つマトリックス層の間に堆積される「サンドイッチ法」27、として定義されている。代替として、CHCA_DHB溶液および試料を0.5mlチューブ内で混合することができ、次いでCHCA薄層12上にスポット。これは、高品質のスペクトルにおいて得られた結晶の均一な層にスポットが得られます。 100kDaのより低い質量を有するタンパク質を分析する場合、DHBの濃度を高くすることができる（ 例えば 60:40 DHB：CHCA）、これはシャープなピークを生成することができますが、測定感度（ すなわちより弱いピーク）を危険にさらす可能性があります。 正しい機器較正のためには、どちらが優れ質量精度を得ることができるように、サンプルスポットに非常に近い較正標準を堆積させることが不可欠である。 「擬似内部キャリブレーション手順」以前に15を示唆された。サンプルスペクトルを取得した後、キャリスポット私は較正sのレーザーショットと信号が試料スペクトルに加えられる。これは、内部​​的に較正ピークを使用したサンプルスペクトルを校正することができます。 レーザーエネルギーはまた、注意深くスペクトル取得中に制御されるべきである。ほとんどの場合、より高いエネルギー感度が増加するが、解像度を低下させる。我々は、収集の感度を損なうことなく、最小限のレーザーエネルギーを用いて示唆している。さらに、スペクトルの品質を向上させるために、人は各サンプルスポット上の複数のショットを取得することができる。通常は、取得するより多くのショット（1,000〜2,000発）、信号の強度が高い。レーザーでスポットを打つ際に試料が均一に分布しているわけではないので、1は、右の位置（ すなわち 「スイートスポット」）を見つける必要があります。あなたは、信号が増加しているまで、同じ地区で撮影した後、サンプルが格納されている別の領域を見つけることを試みること。 行列とSOLVの締結、高純度でエント、試料とターゲットのマトリックス相堆積のために使用される方法は、キャリブレーション、レーザーエネルギーの強度、取得時（ショット/スポットの数）に使用される標準の位置が一つ考慮すべき重要な要因であるMALDI-TOF MSにより、インタクトなタンパク質を分析する。 著者の貢献 LSとEBEは、実験を設計し、質量分析実験を行ってデータを分析し、原稿を書きました。

構造生物学、高品質タンパク質1の生成に依存し、従って、タンパク質分析、2,3ための効率的で信頼性のある技術と結合する必要がある。我々は、タンパク質の一次配列を確認する必要が構造生物学の研究所内で私達の質量分析（MS）の研究室では、 例えば重水素（変異や翻訳後修飾の存在、タンパク質の分解、サンプルの均一性、および同位体標識の品質を評価核磁気共鳴の研究のためのタンパク質4）。構造的な生物学者は、柔軟な部分から構造的に剛性のドメインを区別するために、限られたタンパク質分解を使用しているので、我々は確実にMSを用いたような切断タンパク質を特徴づけるために必要がある。 生体分子がMSによって分析される場合、2つの可能なアプローチは、柔らかく、例えば、重鎖および不安定な分子をイオン化するために利用される。エレクトロスプレーイオン化（ESI）は、直接分子をイオン化する液相5、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）生体分子が、紫外線吸収性の有機分子と共結晶化されることを必要とする（ すなわち、マトリックス分子）6。 それは（50ppmの≤）を高精度に質量決定を可能にするため、ESIの飛行時間型（TOF）MS、液体クロマトグラフィーに結合することは、インタクトなタンパク質の分析のためのルーチン技術となっている。しかしながら、（塩および界面活性剤に特に）サンプル緩衝液の組成および検体信号の抑制を引き起こし、時には排除することが困難である汚染物質（ 即ち、ポリマー）に非常に敏感である。 MALDI-TOF MSは、その性能が少ない緩衝液成分、界面活性剤及び汚染物質の影響を受けるためESI-MSの有効な代替を示し、配列検証のための濃度（500ppm≤）十分な精度を有する無傷のタンパク質の質量を決定することができる。 protei後にnは消化、MALDI-TOF MSは、いわゆる「ペプチドマスフィンガープリンティング」によってさらなる一次配列の確認のために得られたペプチドを分析するために利用することができる。 私たちの手で、（変更または切断のため）100 kDaおよび異機種より大きいインタクトタンパク質の質量測定は、ESI-MSによるよりも、MALDI-MSによる簡単です。これは、ESIスペクトル中に存在する荷電状態分布の重複の欠如によるものである。また、MALDIプロセスは、分析物のサイズ7の依存ではないので、このような方法の収量高感度生体分子質量が100 kDaの以上である場合。無傷のタンパク質の顕著な分析は、1980年代の終わり及び1990年代の初めの間に8-11自家製の器具を用いて行った。 それはサンプル調製のためのより少ない時間を必要とし、interferenを受けにくいため、MALDI-TOF、タンパク質サンプルの品質を評価するためのスクリーニングツールとして使用することができる一般的な不純物（ 例えば塩）によるCES。 MALDI-MSにより、まず、迅速な評価の後、試料は、さらに高い精度でその質量を決定するために、ESI-TOFによって分析することができる。さらに、MALDIは、ESIよりも少ない費用を含むイオンを発生し、そのため、MALDIデータを取得し、解釈することは、より簡単です。これは、構造生物学で働く学生はちょうど簡単な訓練の後、それらの組換えタンパク質を分析することができます。 マトリックスとマトリックス沈着（ 例えば乾燥した液滴8と薄層12-16,17,18）のために使用される技術：2つの重要な要素のMALDIスペクトルの質に影響を与える。単一の有機マトリックス[ 例えば、シナピン酸（SA）19-21又はα-シアノ-4 -ヒドロキシ桂皮酸（α-CHCA）14,22,23]は 、多くの場合、無傷のタンパク質および架橋されたタンパク質複合体のMS試験のために使用される。 α-CHCAを使用して、Chaitグループは、以前のPのための詳細なプロトコルを提示前可溶性および膜タンパク質14,15のMALDI分析に極薄い層をreparing。最近、ゴルカらは 、マトリックス24としてα-CHCAを用いてペプチドおよびタンパク質のMALDI分析を改善するために、グラファイトベースの対象コーティング示さ。 2,5 -ジヒドロキシ安息香酸（DHB）及びα-CHCA 25：ここでは、2つの行列の混合物を利用して、MALDI-TOF MSによるインタクトなタンパク質の分析のための簡単なプロトコルを提示する。私たちは、体系的にタクトタンパク質の制御のために、SAおよびα-CHCAマトリックスに比べDHB-CHCAミックスの性能を評価した。マトリックス混合物は、より良い解決を（タンパク質のピークが非常にシャープであるIE）ができます。また、強烈な複数の電荷のイオンの存在（ すなわち M +2 H 2 +、M +3 H 3 +など）は、軸方向MALDI-TOF機器の分解能が過充電低い質量に高いので（より正確な質量決定を可能にしますのm / z）26。これは、100kDaのより大きなタンパク質の分子量測定のために特に有用である。 高感度もDHB-CHCA混合物（MALDI標的にスポットタンパク質の0.5ピコモル）を使用して到達した。 我々は、上述のように、MALDI機器を使用する際に考慮すべき重要な因子は、マトリックス沈着である。 Laugesen らは、乾燥した打滴を利用して、初めて25 DHB-CHCA混合物の使用を提案した。我々は第一層はアセトンに溶解α-CHCAによって形成される薄層方法を利用しかし、我々は、より良好な結果（ 例えば、より高い感度）を観察した。薄層法の12,27は、以前15 Joveのビデオで説明した、MALDIターゲット上のマトリックス結晶の均質な基層を形成することを意味します。次いで、試料は最終的に、この基体上に堆積し、さらなるマトリックスは、（下記参照）が堆積される。この記事では、我々はまた、MALDIターゲット上のサンプルを堆積させる方法を説明するだけでなく、ターゲット15をきれいにする方法を、再結晶化、およびマトリックスを準備します。 結論するために、我々は、迅速かつ簡単な方法で生産されたタンパク質の品質を評価する必要があるし、MALDI-TOF MSにとても精通した人ではありません（特に、構造生物学者での）科学者にタクトタンパク質を分析するために必要なすべての情報を提供することを目指しています。 1990年代半ば28で予測したように、生物学者へのアクセス性が増加したように、MSは、生物学的研究に増加影響を与えました。我々は、提供された情報が、質量分析法の使用を開始したいと思い、生物学者や科学者へのMALDI-TOFをアクセス可能にするために有用であることを願っています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizima</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin 6 chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0122</td>
			<td>various molecular weight cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>02860</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>05511</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>39319</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 001.222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09676</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Standard II</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>207234</td>
			<td>It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoglobulin G</td>
			<td>ABSciex</td>
			<td>GEN602151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier PURELAB Ultra Analytic</td>
			<td>ELGA LabWater</td>
			<td>89204-052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometric analysis of intact proteins larger than 100 kda

効果的にタンパク質の質量を決定することは、（構造生物学の研究用など ）多くの生物学的研究に不可欠である。正確な質量決定は、一つのタンパク質の一次配列の正しさを評価することができ、変異および/ ​​または翻訳後修飾可能なタンパク質分解、試料の均一性、および標識の場合、同位体の取り込みの程度（ 例えば、13 C標識の存在）。 エレクトロスプレーイオン化（ESI）質量分析（MS）が広く変性タンパク質の質量を決定するために使用されるが、その効率は、サンプル緩衝液の組成によって影響を受ける。具体的には、塩、界面活性剤、および汚染物質の存在が厳しくESI-MSによるタンパク質分析の有効性を損なう。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）MSは、その耐塩性とデータ取得とな解釈を簡単にするために、魅力的な代替手段であるTiONから。また、大きな異質タンパク質（より大きいが100 kDa）の質量の決定は、ESIスペクトル中に存在する高電荷状態分布の重複が存在しないことMALDI-MSにより容易である。 ここでは、飛行時間（TOF）のMALDI-時までに100 kDaのより大きなタンパク質を分析するためにアクセス可能なアプローチを提示する。我々は、試料堆積のためのアプローチとして2つの行列の混合物（ すなわち、2,5 -ジヒドロキシ安息香酸とα-シアノ-4 -ヒドロキシ桂皮酸）、薄層法の有用性を使用することの利点を説明する。また、マトリックスおよび溶媒の純度、較正に使用規格の、レーザーエネルギーの、及び取得時間の重要な役割を議論する。全体的に、我々は、MALDI-MSによる100kDaのより大きなインタクトタンパク質を分析するため、初心者に必要な情報を提供する。

我々は、無傷のタンパク質を分析（染色体領域保守1タンパク質、CRM1と、分子量：123386 Da）で二つの異なる行列、2つの堆積方法、および同一のレーザ強度（ 図1）を用いて。 SAとCHCA_DHB混合物をマトリックスとして利用した。混合物（ 図1AおよびB）、信号対雑音比および感度の点で高品質の質量スペクトルを得た。特に、我々は、MALDI標的（ 図1C）上に堆積されたタンパク質の0.5ピコモルを検出することができた。同量のタンパク質をSA（ 図1D）を用いて、かろうじて検出可能であった。また、マトリックス混合物を用いて、マトリックスの沈着のための選択の方法は、「薄層」アプローチ（ 図1A）であった。 「乾燥した液滴」法を使用して、我々は、質量100kDaのより高い（データは示さず）を有する任意のタンパク質を検出しなかった。 CHCA_DHB混合物（ 図1Aおよび1C）を利用して、proteiの荷電イオンを掛けnは、軸方向MALDI-TOF計器のピーク分解能はのm / z 26に反比例するので、より精度の高い質量決定を可能にする、観察された。 また、単量体のβ-ガラクトシダーゼ（116300ダ）（ 図2）を分析した。 CHCA_DHBスペクトルは、感度、解像度の点でのSAスペクトルよりも良好であった。さらに、多価イオン（M 2 +、M 3 +とM 4 +）の存在は、私たちは、より高い精度でタンパク質の質量（ 図2Aおよび2C）を確認することができました。薄層アプローチを使用して、我々は、免疫グロブリン、IgGの分析（148500ダルトン）（ 図3）のためCHCA_DHB混合物を、SA単独α-CHCAの性能を比較した。我々は、異なるデータを相互に関連付ける際に、タンパク質シグナルは高かったとCHCA_DHBスペクトルの解像度が向上した。結論として、CHCA_DHB混合物を、薄層蒸着法<html> MALDI TOF機器を用いて取得した大規模な無傷のタンパク質の質量スペクトルの質の大幅な改善を示した。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" /> 図1。 123386ダ：無傷の染色体領域のメンテナンス1タンパク質、（CRM1）、分子量のMALDI-TOF分析。 A）CRM1の1ピコモルをマトリックスとしてDHB_CHCAミックスを用いて分析したB）量：1ピコモル、マトリックス：SA C）量：0.5ピコモル;マトリックス：DHB_CHCA D）量：0.5ピコモル;マトリックス：SA。任意の強度単位のスケールで発現ピークの信号は、各スペクトルに存在する最大値に正規化される。 PG &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。無傷のβ-ガラクトシダーゼ（116,300 Da）でのMALDI-TOF分析。 A）金額：20ピコモル、行列DHB_CHCA B）量：20ピコモル;マトリックス：SA C）量：5ピコモル;マトリックス：DHB_CHCA D）金額：5ピコモル;マトリックス：SA。 <img alt="図3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" /> 図3。無傷の免疫グロブリンはIgG（148,500 Da）でのMALDI-TOF分析;量：1.7ピコモルスペクトルはCHCA_DHB混合物を用いて得られた、はるかに強烈であった（最大：8200任意単位、AU）SAスペクトルよりも（最大：1,200オ） α-CHCAスペクトル（最大：4500 AU）

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Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

精密質量測定は、タンパク質の研究における重要なステップである。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法（MS）は、そのような決定のために使用することができ、その主要な利点は、塩、界面活性剤および汚染に対する耐性である。ここでは、MALDI-MSによって100kDaのより大きなタンパク質の分析のためにアクセス可能なアプローチを示している。

フライトのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（MALDI-TOF）100kDaのより大きなインタクトタンパク質の質量分析

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

分取薄層クロマトグラフィーおよびMALDI-TOF質量分析によってバット外皮脂質中トリアシルグリセリドの内容をプロファイリング

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

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