Name: temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

המחברים מודים למתיאס פיטר וקבוצתו במכון לביוכימיה במכון הטכנולוגי בציריך שבו שיטות אלו פותחו. עבודה זו נתמכה על ידי שוויצרי הקרן הלאומית למדע.

1. מדידות מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר של מדיום סינטטי עם שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ב30 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 של תרבות הלילה למחרת בבוקר. </li><li style=";text-align:right...

<ol>
	<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes.">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li><li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes.">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast.">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions.">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li><li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression.">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li><li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase.">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li><li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells.">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry.">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).</li><li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images.">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li><li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering.">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li><li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway.">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li><li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology.">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li></ol>

מיקרוסקופית הטיפול בהיטב עם ConA הוא צעד חיוני כדי להבטיח הדמיה תקינה של התאים. בגלל ConA יש מסיסות נמוכה ב PBS (5 מ&quot;ג / מיליליטר), תהליך הסינון מאפשר הסרת אגרגטים גדולים שנמצאים בפתרון מסונן ולהפריע להדמיה. תאים לצרף יחסית חזק אל פני הש?...

איתות באמצעות מפלי התמרה לעתים קרובות מגיע לשיאו בביטוי של חלבונים. אפיון פרופיל ביטוי זה הוא מרכיב מפתח בהבנת התפקיד של מסלולים ביולוגיים. זיהוי של הספקטרום של חלבונים והדינמיקה של ההפעלה שלהם מוסדר עד יכול להיות מושגת על ידי טכניקות שונות, כגון מיקרו מערכים, כתמים הצפוניים או כתמים מערביים 1-3. עם זאת, טכניקות אלו הן בממוצע התגובה של אוכלוסייה שלמה של תאים. כדי להבין את הרגולציה הקנס של הביטוי של חלבונים, רצוי לאסוף מדידות ברמת התא בודדת. באופן אידיאלי, מדידות אלה אמורות גם לספק נתונים כמותיים נוחים לפתח מודלים מתמטיים של המסלול הבסיסי. מיקרוסקופית וcytometry זרימה הן שתי טכניקות, שמתאימים באופן אידיאלי כדי לספק מדידות תא כזה כמותית אחת. תיוג אנדוגני של חלבונים בחלבון פלואורסצנטי יכול bדואר משמש לכמת רמת הביטוי שלהם 4. עם זאת, מאחר שהתוספת של מחצית ניאון גדולה בתחנה הסופית של החלבון יכולה להבהיר את זה שאינו פונקציונלי, הוא לעתים קרובות רצוי יותר כדי ליצור כתבי ביטוי ספציפיים המבוססים על אמרגן הנהיגה הביטוי למבנה ניאון. חלבון הכתב הזה הוא חיצוני למערכת הסלולרית, ולכן אינו משפיע על אירועי איתות המתרחשים בתא. מיקרוסקופיה וcytometry זרימה שניהם הייתה בשימוש נרחב בתחום איתות השמרים. כדוגמאות; קולמן-לרנר ועמיתים לעבודה מתואמת, בתאים בודדים, הביטוי של הזדווגות כתבים ספציפיים והביעו constitutively על ידי מיקרוסקופ לכמת את הרעש במפל הולכים אותות שמרי הזדווגות 5, Acar ועמיתיו השתמשו cytometry זרימה ללמוד את רשת הרגולציה שליטה על הביטוי של גנים GAL 6. במחקר קודם 7, השתמשנו combinatiבשתי הטכניקות הללו כדי ללמוד את פלט הביטוי מגליצרול osmolarity הגבוה המסלול (HOG) בניצני שמרים. מסלול קינאז חלבון זה mitogen הופעל (MAPK) מופעל על ידי מתח Hyper-האוסמוטי. התוצאה הוא ההפעלה של Hog1 MAPK, אשר translocates לגרעין התא כדי לגרום לתכנית תעתיק וכתוצאה מכך הביטוי של בערך 300 גנים. ללמוד את התהליך הזה, היינו לנו מהונדס כתב ביטוי המבוסס על אמרגן STL1 (גן המושרה באופן ספציפי בתגובה לפעילות Hog1 8) נהיגה הביטוי של חלבון מרובע ונוס ניאון (עמ &#39;STL1-ע&quot;ע). Cytometry זרימת מדידות חשפו את נוכחותם של שתי אוכלוסיות של תאים ברמה בינונית מתח (0.1 M NaCl) עם רק חלק קטן מהאוכלוסייה המבטאת את כתב הניאון. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ כדי לחקור את ההתנהגות הזאת עוד יותר וגילינו שהרעש הזה בביטוי חלבון היה נשלטת על ידי גורמים פנימיים 9. אנחנו could להתבונן עוד כי תאים עם רמה דומה של פעילות Hog1 יכולים להציג תוצאות ביטוי שונות לחלוטין. השילוב של שתי טכניקות אלה אפשר לנו להדגים כיצד שיפוץ האיטי של גנים תגובת לחץ השפיע על תוצאת הביטוי ברמת התא הבודד 7. במאמר זה, אנו משתמשים בביטוי של כתב STL1-ע&quot;ע עמ &#39;הנגרם על ידי הלם Hyper-האוסמוטי כדוגמא לכימות של ביטוי חלבון על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה. אותו הזן נתון 0.2 מתח M NaCl נחקר בשני הטכניקות. זה יאפשר לנו להדגיש כמה הבדלים עיקריים בשתי טכניקות משלימות מאוד אלה.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Yeast Nitrogen Base</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>CYN6202</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>CSM amino-acid mix</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>DCS0011</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Concanavalin A</td>
			 <td>GE Healthcare</td>
			 <td>17-0450-01</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Cycloheximide</td>
			 <td>Fluka Aldrich Sigma</td>
			 <td>C7698</td>
			 <td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>ySP9</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>pSP34</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope</td>
			 <td>Nikon</td>
			 <td>Ti-Eclipse</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope control software</td>
			 <td>Micro-manager</td>
			 <td>Ver 1.4.11</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Incubation chamber</td>
			 <td>LIS</td>
			 <td>The Box</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Fluorescence light source</td>
			 <td>Lumencor</td>
			 <td>SpectraX</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Camera</td>
			 <td>Hamamatsu</td>
			 <td>Flash 4.0</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Flow cytometer</td>
			 <td>BD</td>
			 <td>FACS calibur</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Sonicator bath</td>
			 <td>Telesonic</td>
			 <td>TUC-150</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>8-well-slide </td>
			 <td>Thermo Lab-tek</td>
			 <td>155409</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>96-well-plate</td>
			 <td>Matrical bioscience</td>
			 <td>MGB096-1-2-LG</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>FACS tube</td>
			 <td>BD Falcon</td>
			 <td>352054</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells

כימות של ביטוי גנים ברמת התא הבודד חושפת מנגנוני ויסות רומן מטושטשים במדידות שבוצעו ברמת האוכלוסייה. שתי שיטות מבוססות על מיקרוסקופיה וcytometry זרימה מוצגות כדי להדגים כיצד ניתן לרכוש נתונים כאלה. הביטוי של כתב ניאון המושרה על שפעול מסלול MAPK גליצרול הגבוה osmolarity בשמרים משמש כדוגמא. היתרונות הספציפיים של כל שיטה מודגשים. Cytometry זרימה מודד מספר גדול של תאים (10,000) ומספק מדידה ישירה של הדינמיקה של ביטוי החלבון העצמאי של קינטיקה ההבשלה האיטית של חלבון פלואורסצנטי. הדמיה של תאי חיים על ידי מיקרוסקופ היא לעומת מוגבל למדידה של הטופס התבגר של הכתב בפחות תאים. עם זאת, ערכות נתונים שנוצרו על ידי טכניקה זו יכולה להיות עשיר מאוד הודות לשילובים של כתבים רבים ולמידע המרחב ובזמןהמתקבל מהתאים בודדים. שילוב של שתי שיטות מדידה אלה יכולים לספק תובנות חדשות על הרגולציה של ביטוי חלבון על ידי איתות מסלולים.

מיקרוסקופית תאי שמרים הנושאים את כתב ביטוי p STL1-ע&quot;ע (7 ySP9) הוצמדו לחלק התחתון של השקופית היטב והניחו מתחת למיקרוסקופ. התאים היו מגורה על ידי התוספת של מדיום מתח ישירות לתוך הבאר במהלך פגישת ההדמיה. זה מאפשר לנו לרכוש כמה ...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 3

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

זיהוי של פנוטיפים עיכוב גדילה מושרה על ידי הבעת effectors סוג חיידקית השלישי שמרים

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...