Name: temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

Forfatterne takker Matthias Peter og hans gruppe ved Institutt for biokjemi ved ETH i Zürich hvor disse metodene har blitt utviklet. Dette arbeidet har vært støttet av den sveitsiske National Science Foundation.

En. Mikros Målinger <ol><li> Inokulere 5 ml syntetisk medium med gjær. </li><li> Dyrk celler ved 30 ° C over natten. </li><li> Mål OD 600 av natten kultur neste morgen. </li><li> Spe natten kultur i 5 ml syntetisk medium til od 600 0,05. </li><li> Dyrk den fortynnede kultur ved 30 ° C i minst 4 timer. </li><li> Forbered 3 ganger konsentrert (0,6 M) NaCl-løsning i syntetisk medium. </li><li> Forbered en 1 mg / ml løsning av Concanavalin A (ConA) i PBS. </li><li> Filtratet ~ 200 pl av ConA-l...

<ol>
	<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes.">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li><li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes.">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast.">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions.">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li><li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression.">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li><li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase.">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li><li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells.">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry.">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).</li><li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images.">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li><li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering.">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li><li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway.">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li><li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology.">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li></ol>

Mikros Behandling av brønnen med ConA er et viktig skritt for å sikre en riktig avbildning av cellene. Fordi ConA har lav oppløselighet i PBS (5 mg / ml), kan filtrerings-prosess for fjerning av store aggregater som er tilstede i den ufiltrerte løsning og forstyrre avbildning. Cellene fester relativt sterkt til den behandlede overflate, og tilsetningen av det induserende oppløsningen bør ikke forstyrre lokalisering av cellene, slik at for en kontinuerlig sporing før og etter stimuleringe...

Signalering via transduksjon kaskader ofte kulminerer i uttrykket av proteiner. Karakteriseringen av dette uttrykket profilen er et nøkkelelement for å forstå funksjonen av biologiske mekanismer. Identifiseringen av spekteret av oppregulert proteiner og dynamikken i aktivering kan oppnås ved forskjellige teknikker slik som mikro-matriser, nord blots eller western blots 1-3. Imidlertid er disse teknikker gjennomsnittet responsen fra hele populasjonen av celler. For å forstå den fine regulering av ekspresjonen av proteinene, er det ønskelig å samle inn målinger på celle-nivået. Ideelt sett bør disse målingene også gi kvantitative data mottagelig for å utvikle matematiske modeller av den underliggende bane. Mikroskopi og flowcytometri er to teknikker, som er ideell for å levere slike kvantitative encellete målinger. Den endogene merking av proteiner med et fluorescent protein kan be brukes til å kvantifisere deres uttrykk nivå fire. Imidlertid, siden tilsetningen av et stort fluorescerende rest ved terminus av proteinet kan gjengi det ikke-funksjonelt, er det ofte mer ønskelig å generere spesifikke ekspresjonssystemer reportere basert på en promoter som driver ekspresjonen av et fluoriserende konstruksjon. Denne rapportørprotein er eksogen til mobilsystemet, og derfor ikke påvirker signale hendelser som finner sted i cellen. Både mikroskopi og flowcytometri har blitt mye brukt i gjærsignalfeltet. Som eksempler; Colman-Lerner og kolleger korrelert, i enkeltceller, uttrykk for parring spesifikke og konstitutivt uttrykt reportere ved mikroskopi for å kvantifisere støy i gjær parring signaltransduksjon cascade 5, Acar og kolleger brukte flowcytometri å studere regulatoriske nettverk kontrollere uttrykket av GAL gener seks. I en tidligere studie 7, har vi brukt en Oppkjøpon av disse to teknikker for å studere ekspresjonen utgangen fra høy osmolaritet glycerol (HOG) pathway in spirende gjær. Dette mitogen aktivert protein kinase (MAPK) veien er utløst av hyper-osmotisk stress. Det resulterer i aktivering av MAPK Hog1, som translocates til kjernen av cellen for å indusere en transkripsjonen program som resulterer i ekspresjonen av omtrent 300 gener. For å undersøke denne prosessen hadde konstruerte et uttrykk reporter basert på STL1 promoter (et gen induseres spesifikt i respons til Hog1 aktivitet 8) som driver ekspresjonen av en firedoble Venus fluorescerende protein (p ​​STL1-qV). Strømningscytometri målinger avdekket nærværet av to populasjoner av celler på mellomspenningsnivå (0,1 M NaCl) med bare en del av befolkningen som uttrykker det fluorescerende reporter. Vi brukte mikroskop for å videre undersøke dette problemet og oppdaget at denne støyen i protein uttrykk ble styrt av indre faktorer ni. Vi COUld observere videre at celler med et tilsvarende nivå av Hog1 aktivitet kunne vise påfallende forskjellige uttrykk utfall. Kombinasjonen av disse to teknikkene tillatt oss å demonstrere hvordan den langsomme ombygging av stress respons gener påvirket uttrykket utfallet på celle-nivå syv. I denne artikkelen bruker vi uttrykket av p STL1-qV reporter indusert av hyper-osmotisk sjokk som et eksempel på kvantifisering av protein uttrykk ved mikroskopi og flowcytometri. Samme stamme utsatt til 0,2 M NaCl stresset ble studert med begge teknikkene. Dette vil gi oss mulighet til å fremheve noen viktige forskjeller i disse to svært komplementære teknikker.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Yeast Nitrogen Base</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>CYN6202</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>CSM amino-acid mix</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>DCS0011</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Concanavalin A</td>
			 <td>GE Healthcare</td>
			 <td>17-0450-01</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Cycloheximide</td>
			 <td>Fluka Aldrich Sigma</td>
			 <td>C7698</td>
			 <td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>ySP9</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>pSP34</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope</td>
			 <td>Nikon</td>
			 <td>Ti-Eclipse</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope control software</td>
			 <td>Micro-manager</td>
			 <td>Ver 1.4.11</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Incubation chamber</td>
			 <td>LIS</td>
			 <td>The Box</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Fluorescence light source</td>
			 <td>Lumencor</td>
			 <td>SpectraX</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Camera</td>
			 <td>Hamamatsu</td>
			 <td>Flash 4.0</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Flow cytometer</td>
			 <td>BD</td>
			 <td>FACS calibur</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Sonicator bath</td>
			 <td>Telesonic</td>
			 <td>TUC-150</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>8-well-slide </td>
			 <td>Thermo Lab-tek</td>
			 <td>155409</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>96-well-plate</td>
			 <td>Matrical bioscience</td>
			 <td>MGB096-1-2-LG</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>FACS tube</td>
			 <td>BD Falcon</td>
			 <td>352054</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells

Kvantifisering av genuttrykk på celle-nivå avdekker nye reguleringsmekanismer skjult i målinger utført på befolkningsnivå. To metoder basert på mikroskopi og flowcytometri presenteres for å demonstrere hvordan slike data kan bli kjøpt opp. Ekspresjonen av et fluorescerende reporter indusert ved aktivering av den høye osmolaritet glycerol MAPK veien i gjær blir brukt som eksempel. De spesifikke fordeler ved hver metode er uthevet. Strømningscytometri måler et stort antall av celler (10 000), og gir et direkte mål på dynamikken i proteinekspresjon uavhengig av den langsomme kinetikk modning av det fluorescerende protein. Avbilding av levende celler ved mikroskopi er derimot begrenset til målingen av den modne form av reporteren i færre celler. Imidlertid kan de datasettene som genereres av denne teknikken være ekstremt rike takket være kombinasjoner av flere journalister og til romlig og tidsmessig informasjonoppnådd fra individuelle celler. Kombinasjonen av disse to målemetoder kan levere nye innsikter om regulering av protein uttrykk ved signalveier.

Mikros Gjærceller som bærer uttrykket reporter p STL1-qV (ySP9 7) ble festet til bunnen av brønnen-slide og plassert under mikroskopet. Cellene ble stimulert ved tilsetning av stresset medium direkte inn i brønnen i løpet av avbildnings sesjon. Dette gir oss muligheten til å skaffe seg et par bilder av cellene før pathway induksjon og følge deres skjebne etter stimulering. I det foreliggende tilfelle ble cellene fulgt i ~ 2 timer med et intervall på 10 min. ...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

To komplementære fremgangsmåter basert på strømningscytometri og mikros presenteres som muliggjør kvantifiseringen, på celle-nivået, av dynamikken i genekspresjon indusert ved aktivering av en MAPK veien i gjær.

Temporal Kvantifisering av MAPK Induced Expression i Enkeltgjærceller

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Spatial Omorganisering av et MAPK signalveien Bruke Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Ved hjelp av mikrofluid enheter for å måle levetid og Cellular fenotyper i enkelt spirende gjærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brukergrensesnitt for programvareassistert sporing av proteinkonsentrasjon i dynamiske cellulære protrusjoner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...