Name: temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

Авторы благодарят Маттиас Петра и его группу в Институте биохимии в ETH в Цюрихе, где были разработаны эти методы. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Швейцарии.

1. Микроскопии Измерения <ol><li> Инокулировать 5 мл синтетической среде с дрожжами. </li><li> Рост клеток при 30 ° С в течение ночи. </li><li> Измерьте OD 600 из ночной культуры на следующее утро. </li><li> Развести ночной культуры в 5 мл синтетической среде с OD 600 0,05. </li><li> Grow разбавленной культур...

<ol>
	<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes.">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li><li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes.">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast.">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions.">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li><li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression.">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li><li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase.">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li><li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells.">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry.">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).</li><li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images.">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li><li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering.">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li><li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway.">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li><li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology.">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li></ol>

Микроскопия Лечение колодца с ConA является важным шагом для обеспечения надлежащего изображений клеток. Поскольку ConA имеет низкую растворимость в PBS (5 мг / мл), процесс фильтрования позволяет удаление больших агрегатов, которые присутствуют в нефильтрованной раствора и м?...

Сигнализация с помощью трансдукции каскадов часто достигает кульминации в экспрессии белков. Характеристика этого профиля экспрессии является ключевым элементом в понимании функции биологических путей. Идентификация спектра до регулируемых белков и динамики их активации может быть достигнуто различными способами, такими как микро-массивов, северных пятнами или западных помарки 1-3. Однако, эти методы в среднем отклик всей популяции клеток. Чтобы понять тонкую регуляцию экспрессии белков, желательно, чтобы собрать измерения на уровне одной клетки. В идеале, эти измерения должны также обеспечить количественные данные поддаются развивать математические модели базового пути. Микроскопия и проточной цитометрии две методики, которые идеально подходят для доставки таких количественных измерений одной ячейки. Эндогенный мечение белков с флуоресцентным белком может бе используется для количественной оценки их уровня экспрессии 4. Однако, так как добавление большого флуоресцентного фрагмента в конце белка может сделать его нефункциональным, часто более желательны, чтобы генерировать определенные репортеров экспрессии на основе промотора движущей экспрессию флуоресцентного конструкции. Этот репортер белок экзогенными для сотовой системы и, следовательно, не влияет на сигнальные события, которые происходят в клетке. Оба микроскопии и проточной цитометрии были широко использованы в поле сигнализации дрожжей. В качестве примеров; Колман-Лернер и его коллеги коррелирует, в одиночных камерах, выражение спаривания конкретные и конструктивно, высказанные журналистам с помощью микроскопии для количественной оценки шума в дрожжи спаривания передачи сигнала каскада 5, Акар и его коллеги использовали проточной цитометрии для изучения нормативно-сеть контролирующий экспрессию генов GAL 6. В предыдущем исследовании 7, мы использовали combinatiна этих двух методов для изучения выход экспрессии с высокой осмолярности глицерина (HOG) тропа в почкующихся дрожжей. Это митоген активированной протеинкиназы (МАРК) пути инициируется гипер-осмотического стресса. Это приводит к активации MAPK Hog1, который перемещает в ядро ​​клетки, чтобы вызвать программу транскрипции, что приводит к экспрессии примерно 300 генов. Для изучения этого процесса, мы инженерии выражения репортера на основе STL1 промоутер (гена индуцируется в частности, в ответ на Hog1 деятельности 8) движущей выражение четырехместном Венеры флуоресцентного белка (р STL1-см.). Проточной цитометрии измерения обнаружили наличие двух популяций клеток на среднем уровне напряжения (0,1 М NaCl) и только часть населения, выражающей флуоресцентного репортера. Мы использовали микроскопию для дальнейшего расследования это поведение и обнаружил, что этот шум в экспрессии белка регулируется внутренними факторами 9. Мы CoUл.д. далее заметить, что клетки с аналогичным уровнем Hog1 деятельности может отображать поразительно разные результаты экспрессии. Сочетание этих двух методов позволило нам продемонстрировать, как медленно ремоделирования генов стресс-ответа повлияло на исход выражение в одном уровне клетки 7. В данной работе мы используем выражение р STL1-QV репортера, вызванного гипер-осмотического шока в качестве примера количественной оценки экспрессии белка по микроскопии и проточной цитометрии. Этот же штамм подвергается 0,2 М NaCl стресса изучали с обоих методов. Это позволит нам выделить несколько ключевых различия в этих двух весьма дополнительных методов.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Yeast Nitrogen Base</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>CYN6202</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>CSM amino-acid mix</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>DCS0011</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Concanavalin A</td>
			 <td>GE Healthcare</td>
			 <td>17-0450-01</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Cycloheximide</td>
			 <td>Fluka Aldrich Sigma</td>
			 <td>C7698</td>
			 <td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>ySP9</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>pSP34</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope</td>
			 <td>Nikon</td>
			 <td>Ti-Eclipse</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope control software</td>
			 <td>Micro-manager</td>
			 <td>Ver 1.4.11</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Incubation chamber</td>
			 <td>LIS</td>
			 <td>The Box</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Fluorescence light source</td>
			 <td>Lumencor</td>
			 <td>SpectraX</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Camera</td>
			 <td>Hamamatsu</td>
			 <td>Flash 4.0</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Flow cytometer</td>
			 <td>BD</td>
			 <td>FACS calibur</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Sonicator bath</td>
			 <td>Telesonic</td>
			 <td>TUC-150</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>8-well-slide </td>
			 <td>Thermo Lab-tek</td>
			 <td>155409</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>96-well-plate</td>
			 <td>Matrical bioscience</td>
			 <td>MGB096-1-2-LG</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>FACS tube</td>
			 <td>BD Falcon</td>
			 <td>352054</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells

Количественная оценка экспрессии генов на уровне одной клетки раскрывает новые регуляторные механизмы уведут в измерениях, выполненных на уровне населения. Два методы, основанные на микроскопии и проточной цитометрии представлены продемонстрировать, как такие данные могут быть приобретены. Выражение флуоресцентного репортера, индуцированной при активации высокой осмолярности глицерин пути МАРК в дрожжах используется в качестве примера. Особые преимущества каждого метода выделены. Проточная цитометрия измеряет большое количество клеток (10000) и обеспечивает прямое измерение динамики белка экспрессии независимо от медленных созревания кинетики флуоресцентного белка. Изображений живых клеток с помощью микроскопа является напротив ограничено измерением зрелой форме репортера в меньшем количестве клеток. Тем не менее, наборы данных, генерируемые этой техники может быть чрезвычайно богатые благодаря комбинации нескольких репортеров и в пространственном и временном информацииполучены из отдельных клеток. Сочетание этих двух методов измерений может доставить новый взгляд на регуляцию экспрессии белка на сигнальных путей.

Микроскопия Клетки дрожжей, несущие выражение репортер р STL1-QV (ySP9 7) были прикреплены к нижней части скважины горкой и помещен под микроскопом. Клетки стимулировали добавлением напряжений среды непосредственно в скважине в ходе сеанса изображения. Это позволяе...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Два дополнительных методы, основанные на цитометрии потока и микроскопии представлены которые позволяют количественно, в уровне одной клетки, динамики экспрессии генов, вызванных активацией MAPK пути в дрожжах.

Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 3

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Экспрессия рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжей Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Идентификация фенотипов ингибирование роста индуцированной экспрессии бактериального типа создания эффектов III в Дрожжи

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Анализ глобальной РНК синтеза на уровне одной клетки следующем Гипоксия

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Визуализация пространственной реорганизацией МАРК сигнального пути с помощью переходного процесса система экспрессии Tobacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Использование микрофлюидальных устройств для измерения срок службы и сотовых фенотипов в одиночных дрожжевых клетках почкования

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...