Name: temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

Los autores agradecen a Matthias Peter y su grupo en el Instituto de Bioquímica de la ETH en Zürich, donde se han desarrollado estos métodos. Este trabajo ha sido financiado por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza.

1. Medidas de Microscopía <ol><li> Inocular 5 ml de medio sintético con levadura. </li><li> Se cultivan las células a 30 º C durante la noche. </li><li> Mida la OD 600 de la cultura de la noche a la mañana siguiente. </li><li> Diluir la cultura durante la noche en 5 ml de medio sintético a OD 600 0.05. </li><li> Mantener el cultivo diluido a 30 ° C durante al menos 4 horas. </li><li> Preparar 3 veces concentrado (0,6 M) una solución de NaCl en medio sintético. </li><li> Preparar una solu...

<ol>
	<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes.">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li><li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes.">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast.">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions.">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li><li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression.">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li><li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase.">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li><li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells.">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry.">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).</li><li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images.">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li><li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering.">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li><li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway.">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li><li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology.">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li></ol>

Microscopía El tratamiento del pozo con ConA es un paso esencial para asegurar una imagen adecuada de las células. Debido a ConA tiene baja solubilidad en PBS (5 mg / ml), el proceso de filtración permite la eliminación de grandes agregados que están presentes en la solución sin filtrar y interfieren con la formación de imágenes. Las células se adhieren relativamente fuerte a la superficie tratada y la adición de la solución de la inducción no deben perturbar la localización de las...

La señalización a través de cascadas de transducción menudo culmina en la expresión de proteínas. La caracterización de este perfil de expresión es un elemento clave en la comprensión de la función de las vías biológicas. La identificación de espectro de hasta reguladas proteínas y la dinámica de su activación se puede lograr mediante diversas técnicas como la micro-arrays, transferencias Northern o transferencias Western 1-3. Sin embargo, estas técnicas promedio de la respuesta de toda una población de células. Para entender la regulación fina de la expresión de proteínas, es deseable para reunir mediciones en el nivel de células individuales. Lo ideal sería que estas medidas también deben proporcionar datos cuantitativos susceptibles de desarrollar modelos matemáticos de la vía subyacente. Microscopía y citometría de flujo son dos técnicas, que son ideales para ofrecer este tipo de mediciones cuantitativas de células individuales. El etiquetado endógena de proteínas con una proteína fluorescente puede be utilizado para cuantificar su nivel de expresión 4. Sin embargo, ya que la adición de un resto fluorescente grande en la parte terminal de la proteína puede hacer que no sea funcional, a menudo es más deseable generar reporteros de expresión específicos basados ​​en un promotor que dirige la expresión de una construcción fluorescente. Esta proteína indicadora es exógeno al sistema celular y por lo tanto no influye en los eventos de señalización que están teniendo lugar en la célula. Tanto la microscopía y citometría de flujo han sido ampliamente utilizados en el campo de la señalización de la levadura. Como ejemplos, los compañeros de trabajo-Colman Lerner y correlacionados, en celdas individuales, la expresión de apareamiento periodistas específicos y constitutivamente expresadas por microscopía de cuantificar el ruido en el apareamiento de levadura de transducción de señales en cascada 5, Acar y sus colegas utilizaron citometría de flujo para el estudio de la red de regulación el control de la expresión de los genes GAL 6. En un estudio anterior 7, hemos utilizado un combinatien una de estas dos técnicas para estudiar la salida de la expresión de la alta osmolaridad de glicerol (HOG) y la vía de levadura en ciernes. Esta proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) es provocada por el estrés hiper-osmótica. Es el resultado de la activación de las MAPK Hog1, que se transloca al núcleo de la célula para inducir un programa transcripcional que resulta en la expresión de aproximadamente 300 genes. Para estudiar este proceso, habíamos diseñado un reportero de expresión basado en el promotor STL1 (un gen inducido específicamente en respuesta a la actividad Hog1 8) que dirige la expresión de una proteína fluorescente Venus cuádruple (p STL1-qV). La citometría de flujo mediciones revelaron la presencia de dos poblaciones de células en el nivel de la tensión intermedia (NaCl 0,1 M) con sólo una fracción de la población que expresa el indicador fluorescente. Se utilizó microscopía de investigar más a fondo este comportamiento y descubrimos que este ruido en la expresión de proteínas se rige por factores intrínsecos 9. Nos COUld observan, además, que las células con un nivel similar de actividad Hog1 podrían mostrar resultados sorprendentemente diferentes de expresión. La combinación de estas dos técnicas nos ha permitido demostrar cómo la lenta remodelación de genes de respuesta al estrés influyó en el resultado de expresión a nivel de células individuales 7. En este trabajo, utilizamos la expresión de la p-STL1 qV reportero inducida por choque hiper-osmótica como un ejemplo de la cuantificación de la expresión de proteínas por microscopía y citometría de flujo. La misma cepa sometida a estrés 0,2 M de NaCl se estudió con ambas técnicas. Esto nos permitirá poner de relieve algunas diferencias clave en estas dos técnicas altamente complementarias.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Yeast Nitrogen Base</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>CYN6202</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>CSM amino-acid mix</td>
			 <td>ForMedium</td>
			 <td>DCS0011</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Concanavalin A</td>
			 <td>GE Healthcare</td>
			 <td>17-0450-01</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Cycloheximide</td>
			 <td>Fluka Aldrich Sigma</td>
			 <td>C7698</td>
			 <td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>ySP9</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>pSP34</td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td></td>
			 <td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope</td>
			 <td>Nikon</td>
			 <td>Ti-Eclipse</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Microscope control software</td>
			 <td>Micro-manager</td>
			 <td>Ver 1.4.11</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Incubation chamber</td>
			 <td>LIS</td>
			 <td>The Box</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Fluorescence light source</td>
			 <td>Lumencor</td>
			 <td>SpectraX</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Camera</td>
			 <td>Hamamatsu</td>
			 <td>Flash 4.0</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Flow cytometer</td>
			 <td>BD</td>
			 <td>FACS calibur</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>Sonicator bath</td>
			 <td>Telesonic</td>
			 <td>TUC-150</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>8-well-slide </td>
			 <td>Thermo Lab-tek</td>
			 <td>155409</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>96-well-plate</td>
			 <td>Matrical bioscience</td>
			 <td>MGB096-1-2-LG</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			 <td>FACS tube</td>
			 <td>BD Falcon</td>
			 <td>352054</td>
			 <td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

temporal quantification of mapk induced expression in single yeast cells

La cuantificación de la expresión génica a nivel de células individuales descubre nuevos mecanismos de regulación oscurecidas en las mediciones realizadas a nivel de población. Se presentan dos métodos basados ​​en la microscopía y citometría de flujo para demostrar cómo se pueden adquirir esos datos. La expresión de un indicador fluorescente inducida tras la activación de la alta osmolaridad MAPK vía de glicerol en la levadura se utiliza como un ejemplo. Se destacan las ventajas específicas de cada método. La citometría de flujo mide un gran número de células (10.000) y proporciona una medida directa de la dinámica de la expresión de la proteína independiente de la cinética lenta maduración de la proteína fluorescente. Obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía es por el contrario limitado a la medición de la forma madurado del reportero en un menor número de células. Sin embargo, los conjuntos de datos generados por esta técnica pueden ser extremadamente rico gracias a la combinación de varios periodistas ya la información espacial y temporalobtenido a partir de células individuales. La combinación de estos dos métodos de medición puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la regulación de la expresión de proteínas por las vías de señalización.

Microscopía Las células de levadura que llevan el reportero de la expresión de P-STL1 qV (ySP9 7) se adjunta a la parte inferior del pozo-portaobjetos y se coloca bajo el microscopio. Las células se estimularon mediante la adición de medio de estrés directamente en el pozo durante el curso de la sesión de formación de imágenes. Esto nos permite adquirir unas pocas imágenes de las células antes de la inducción vía y seguir su destino después de la estimulación....

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells at JoVE.com

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Dos métodos complementarios basados ​​en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Investigación

Biología

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 3

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Identificación de los fenotipos de inhibición del crecimiento inducida por la expresión de tipo bacteriana efectores III en la levadura

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...