Name: models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers
Uploaded: 2013-10-17T19:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een beurs van het Howard Hughes Medical Institute en de National Science Foundation om RG, en fondsen te SM uitgereikt door de National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) en de American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).

1. Het kweken van een monolaag van cellen in Transwell Inserts <ol><li> In een steriele, bioveiligheidsniveau 2 celkweek kap, plaatst 0,8 mm porie PET Transwell inserts in een 24-well plaat (4 wells per conditie, voor statistische significantie) met een pincet. Alle materialen die gebruikt de kap moet worden gesteriliseerd met ethanol. </li></ol> Opmerking: De poriegrootte van de filter moet worden geselecteerd in overeenstemming met de gemiddelde grootte van de NC gebruikte transport mogel...

<ol>
	<li>Deli, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+tight+junction+modulators+to+reversibly+open+membranous+barriers+and+improve+drug+delivery.">Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).</li><li>Mrsny, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+nature:+"Pathogen-Mimetic"+systems+for+mucosal+nano-medicines.">Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+and+stimuli-sensitive+pharmaceutical+nanocarriers.">Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).</li><li>Sadekar, S., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+transport+and+toxicity+of+PAMAM+dendrimers:+implications+for+oral+drug+delivery.">Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).</li><li>Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+design+and+characterization+of+ligand-targeted+drug+delivery+systems.">Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems.</a> J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).</li><li>Volkheimer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persorption+of+particles:+physiology+and+pharmacology.">Persorption of particles: physiology and pharmacology.</a> Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).</li><li>Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cell+junctions:+happy+together.">Endothelial cell-cell junctions: happy together.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).</li><li>Jung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+oral+delivery+of+peptides:+is+there+a+role+for+polymers+to+affect+mucosal+uptake.">Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).</li><li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers.">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li><li>Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+epithelial+cell+culture+in+studies+of+drug+transport.">Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport.</a> Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).</li><li>Bareford, L. M., Swaan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+mechanisms+for+targeted+drug+delivery.">Endocytic mechanisms for targeted drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).</li><li>Tuma, P. L., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcytosis:+crossing+cellular+barriers.">Transcytosis: crossing cellular barriers.</a> Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).</li><li>Muro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocytic+pathway+induced+by+clustering+endothelial+ICAM-1+or+PECAM-1.">A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1.</a> J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).</li><li>Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Caco-2+cell+monolayers+in+prediction+of+intestinal+drug+absorption.">Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption.</a> Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).</li><li>Delie, F., Rubas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colonic+cell+line+sharing+similarities+with+enterocytes+as+a+model+to+examine+oral+absorption:+advantages+and+limitations+of+the+Caco-2+model.">A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model.</a> Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).</li><li>Kuhnline Sloan, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+and+biological+methods+for+probing+the+blood-brain+barrier.">Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).</li><li>Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional,+all-human+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+using+mono-,+co-,+and+tri-cultivation+Transwell+models.">Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models.</a> J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).</li><li>Kasper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flotillin-involved+uptake+of+silica+nanoparticles+and+responses+of+an+alveolar-capillary+barrier+in+vitro.">Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).</li><li>Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+nanocarriers+across+gastrointestinal+epithelial+cells+by+a+new+transcellular+route+induced+by+targeting+ICAM-1.">Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1.</a> J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).</li><li>Hsu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+endothelial+delivery+and+biochemical+effects+of+alpha-galactosidase+by+ICAM-1-targeted+nanocarriers+for+Fabry+disease.">Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease.</a> J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).</li><li>Schmiedlin-Ren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+enhanced+oral+availability+of+CYP3A4+substrates+by+grapefruit+constituents.+Decreased+enterocyte+CYP3A4+concentration+and+mechanism-based+inactivation+by+furanocoumarins.">Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins.</a> Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).</li><li>Hughes, J., Crowe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+P-glycoprotein-mediated+efflux+of+digoxin+and+its+metabolites+by+macrolide+antibiotics.">Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics.</a> J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).</li><li>Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transepithelial+drug+transport+by+on-line+measurement:+cellular+control+of+paracellular+and+transcellular+transport.">In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport.</a> J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).</li><li>Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+from+molecular+mechanisms+to+therapeutics.">Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics.</a> Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).</li><li>Kapus, A., Szaszi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+apical+and+paracellular+transport+processes.">Coupling between apical and paracellular transport processes.</a> Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).</li><li>Hood, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+protection+by+PECAM-targeted+delivery+of+a+novel+NADPH-oxidase+inhibitor+to+the+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo.</a> J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).</li><li>Simone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+targeting+of+polymeric+nanoparticles+stably+labeled+with+the+PET+imaging+radioisotope+iodine-124.">Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124.</a> Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).</li><li>Vercauteren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li></ol>

De hierboven besproken werkwijzen kan een cel model voor het bestuderen transport gerichte NC in cellulaire barrières worden vastgesteld, zoals het voorbeeld van Caco-2 epitheelcellen, waarvan evalueren vervoer van het GI lumen in het bloed bij betrokken is van orale drug delivery systemen. Kweken van GI epitheliale celmonolagen in transwell inserts ingeschakeld meting van TEER en fluorescentie immunostaining van krappe kruispunten om de vorming van een cel permeabiliteitsbarrière bevestigen. Vervolgens radiolabeling ...

Cellulaire barrières in het lichaam fungeren als een gateway tussen de externe omgeving en de interne compartimenten. Dit geldt voor de epitheliale bekleding scheidt het extern blootgestelde oppervlak van de gastro-intestinale (GI) kanaal en de bloedbaan 1-3. Cellulaire belemmeringen vertegenwoordigen ook de interface tussen de bloedbaan en de parenchym en cellulaire componenten van weefsels en organen. Dit geldt voor de binnenste endotheliale bekleding van bloedvaten, zoals de bloed-long barrière, de bloed-hersenbarrière, enz. 1 Het vermogen om deze cellulaire barrières te doorkruisen in het lichaam is cruciaal voor efficiënte levering van therapeutische en diagnostische middelen in de circulatie en weefsels / organen waar interventie nodig is. Om de levering van therapeutische of diagnostische middelen te verbeteren, kunnen deze verbindingen in sub-micrometer nanocarriers (NC&#39;s) worden geladen. Deze drug delivery vehicles kunnen worden geformuleerd met verschillendechemie en structuren om drugs oplosbaarheid, bescherming, farmacokinetiek, de release en de stofwisseling 4,5 optimaliseren. NC kunnen worden gefunctionaliseerd met affiniteit of richtende delen (bijvoorbeeld antilichamen, peptiden suikers, aptameren, enz.) om hechting aan gebieden van het lichaam waar de therapeutische werking vereist 2,6 vergemakkelijken. Targeting van NC&#39;s naar determinanten op het oppervlak van cellulaire barrières kunnen het vervoer verder te vergemakkelijken in en / of over deze voeringen 2,6. De rol van selectief transport van stoffen tussen twee omgevingen vereist een aantal unieke functies onder cellagen. Een dergelijke functie is celpolariteit, waarbij de apicale membraan tegenover het lumen van holten varieert van het basolaterale membraan gericht weefsel interstitium met betrekking tot membraan morfologie en samenstelling van lipiden, transporters en 2 receptoren. Een ander kenmerk betreft intercellulaire junctions verbinden aangrenzende cellen. Regulatie van de eiwitten die krappe kruispunten, met name junctionele adhesiemoleculen (files), occludins en Claudins vormen, moduleren de barrièrefunctie selectief toestaan ​​of niet transport van stoffen tussen cellen, bekend als paracellulaire vervoer, waardoor passage van materialen uit het lumen naar de basolaterale ruimte 3. Binding van vele natuurlijke en synthetische elementen (leukocyten, moleculen, deeltjes en drug delivery systemen) om cellulaire barrières in het lichaam cel-junction opening induceren, die voorbijgaand en relatief onschadelijke of meer langdurig zijn en dus onveilig toegang van ongewenste stoffen over de barrière 2,5,7-9. Bijgevolg kan dit traject worden bepaald door het meten van de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en passieve paracellulaire diffusie van moleculen (hierin genoemd paracellulaire lekkage), waarbij verminderde weerstand tegen elektrische stroom of verhoogde paracellulaire lekkage een inert verbinding in de basolaterale ruimte geven opening van de cel contacten, respectievelijk 5,10,11. Ter aanvulling van deze methoden, kan een van de tight junction eiwitten hierboven genoemde worden gekleurd om hun integriteit te beoordelen, waar vlekken moeten verschijnen geconcentreerd bij de cel-cel grenzen rondom de cel periferie 5,10,12. Alternatief kan geneesmiddelafgiftesystemen die specifieke celoppervlak determinanten zoals die geassocieerd met clathrine beklede putjes of kolf-vormige membraan invaginations genoemd caveolae, gericht vesiculaire opname activeren in cellen door endocytose, die een weg voor geneesmiddelafgifte intracellulaire compartimenten 5, 13. Bovendien kan endocytose leiden tot transport van vesikels in het cellichaam voor vrijgave aan de basolaterale zijde een fenomeen transyctosis of transcellulair transport 14. Daarom kan kennis van de kinetiek en het mechanisme van endocytose worden gebruikt voor een intracellulaire exploiterennd transcellulaire drug delivery, die een relatief veilige en gecontroleerde wijze van levering biedt in vergelijking met de paracellulaire route. Het mechanisme van endocytose worden beoordeeld modulatoren van klassieke routes (clathrine-en-caveolin endocytose en macropinocytose) of niet-klassieke routes (zoals bij celadhesie molecuul (CAM)-gemedieerde endocytose) 5,13,15 . Dat intracellulair verkeer vaak bestudeerd in standaard putjes of dekglaasjes, het ontbreken van een basolaterale compartiment sluit cel polarisatie en de mogelijkheid om transport te bestuderen in cellagen. Om dit probleem te omzeilen, is transport over cel monolagen werden lang bestudeerd met Transwell inzetstukken 10,11,16,17, die bestaan ​​uit een bovenste (apicaal) kamer, een poreus membraan permeabel waar cellen hechten en een hecht monolaag, en een onderste (basolaterale) kamer (figuur 1). In deze configuratie kan het transport worden gemeten in deapicale naar basolaterale richting door toediening van een behandeling in de bovenste kamer, na het transport door de cel monolaag en de onderliggende poreuze membraan, en uiteindelijk verzamelen van het medium in de onderste kamer voor het kwantificeren van transportgoed. Vervoer in de basolaterale-to-apicale richting kan ook worden gemeten door de eerste toediening aan de Tweede Kamer en de daaropvolgende verzameling van de bovenste kamer 5,10,12,16. Verschillende technieken bestaan ​​om de vorming van barrièrelaag op transwells, waaronder TEER en paracellulaire transport assays controleren, zoals hierboven beschreven. Bovendien kan het permeabele filter waarop cellen gekweekt worden verwijderd beeldverwerkingsanalyses (bijv. fluorescentie, confocale, elektronenmicroscopie) als verdere bevestiging van de cel monolaag model en het mechanisme van transport. Keuze van het membraan, die beschikbaar is in verschillende poriegrootte, materialen en oppervlakken, is afhankelijk van verschillende factors zoals de omvang van stoffen of voorwerpen worden vervoerd, celtype, en imaging methode 16,18-20. Transwell inzetstukken ook gecontroleerd en kwantificatie van vervoer te vergemakkelijken ten opzichte van complexe zoogdiersystemen, als volumes van de kamers en celoppervlak bekend constanten. Hoewel veel factoren betrokken bij in vivo afgifte worden geëlimineerd, waaronder de aanwezigheid van darmslijmvlies, schuifspanning, spijsverteringsenzymen, immuuncellen, enz. Dit kleine schaal in vitro model biedt nuttige voorafgaande informatie over transport. Als een voorbeeld voor de aanpassing van deze methoden om NC transport te bestuderen over cellulaire barrières 10,11,16,17 illustreren, beschrijven we hier een geval waarin het potentieel voor NC transport over de GI epitheel werd gemodelleerd door het beoordelen van de passage van een model drug delivery systeem via een monolaag van menselijke epitheliale colorectale adenocarcinoma (Caco-2 cellen). Hiertoe cellen werden gekweekt in Transwell inzetstukken, een 0,8 um porie polyethyleentereftalaat (PET) filter (6,4 mm diameter), die transparant is en kan worden gebruikt voor microscopie. De status van de barrièrelaag wordt gevalideerd door TEER, apicale naar basolaterale transport van een controlestof, albumine en fluorescentie microscopie visualisatie van een element van de tight junctions, occludin eiwit. Een model van gerichte polymeer NC wordt gebruikt, bestaande uit 100 nm, niet biologisch afbreekbare polystyreen nanodeeltjes. NC worden bekleed door oppervlakte adsorptie met een targeting antilichaam alleen of een combinatie van een gericht antilichaam en therapeutisch lading, waarbij elke component met 125 I radioisotoop tracering kan worden gemerkt. In het gekozen voorbeeld, het antilichaam intercellulaire adhesiemolecuul-1 (ICAM-1) herkent een eiwit op het oppervlak van GI epitheel (en andere) cellen, waarvan is aangetoond dat intracellulair transcellulair transport o vergemakkelijken<html> f drug carriers en hun lading 21. De lading alfa-galactosidase (α-Gal) een therapeutisch enzym voor behandeling van de ziekte van Fabry, een erfelijke lysosomale stapelingsziekte 22. De beklede NC, ongeveer 200 nm groot, toegevoegd aan de apicale kamer via cel monolaag en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende variërende tijdsperioden, waarna 125I op NC kan worden gedetecteerd gekoppeld aan de cel monolaag en / of getransporteerd naar de basolaterale kamer onder de cellen. Aanvullende bepaling van vrije 125 Ik laat aftrekken van de gedegradeerde fractie en de schatting van gecoate NC vervoer. Het mechanisme van transport wordt verder bepaald door onderzoek van veranderingen in de barrièrelaag betrekking tot de paracellulaire route, door de hierboven beschreven parameters, terwijl transcellulair transport wordt bepaald door het onderzoeken van veranderingen in het transport wanneer moduleren wegen van endocytose en transcytose. NHOUD &quot;&gt; Deze methoden geven waardevolle informatie over cellulaire barrière modellen, de mate en snelheid van transport van een drug delivery systeem, en het mechanisme van dit vervoer, helemaal die interpretatie van de mogelijkheden voor drug delivery over cellulaire barrières.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

Sub-micrometer dragers (nanocarriers; NC&#39;s) te verbeteren werkzaamheid van geneesmiddelen door het verbeteren van de oplosbaarheid, stabiliteit, omlooptijd, targeting en release. Bovendien doorkruisen cellulaire barrières in het lichaam is cruciaal voor zowel de orale toediening van therapeutische NC&#39;s in het verkeer en vervoer van het bloed naar de weefsels, waar interventie nodig is. NC transport over cellulaire barrières wordt bereikt door: (i) de paracellulaire route via tijdelijke verstoring van de knooppunten die aangrenzende cellen of (ii) de transcellulaire route, waarbij materialen worden geïnternaliseerd door endocytose, in het cellichaam getransporteerd en uitgescheiden interlock aan de andere celoppervlak (transyctosis). Levering in heel cellulaire barrières kunnen worden vergemakkelijkt door het koppelen van therapeutica of hun dragers met targeting agents die specifiek binden aan het celoppervlak merkers betrokken bij het transport. Hier bieden we methoden om de omvang en het mechanisme van NC transport over een model celbarrière, while metench bestaat uit een monolaag van gastro-intestinale (GI) epitheelcellen gegroeid op een poreus membraan in een Transwell insert. Vorming van een permeabiliteitsbarrière wordt bevestigd door metingen transepithele elektrische weerstand (TEER), transepitheliaal transport van een controle-stof, en immunokleuring van tight junctions. Als voorbeeld, worden ~ 200 nm polymeer NC&#39;s gebruikt die een therapeutische lading dragen en zijn bekleed met een antilichaam dat een cel-oppervlak determinant richt. Het antilichaam of therapeutische lading gemerkt met 125I voor radioisotoop gemerkte opsporing en NC&#39;s worden toegevoegd aan de bovenste kamer via celmonolaag gedurende variërende tijdsperioden. NC geassocieerd met de cellen en / of naar de onderliggende kamer worden gedetecteerd. Meting van gratis 125 Ik laat aftrekken van de gedegradeerde fractie. De paracellulaire route wordt beoordeeld door het bepalen van mogelijke veranderingen door NC vervoer tot de dam parameters hierboven beschreven. Transcellulaire vervoer iTussen bepaald door het aanpakken van het effect moduleren endocytose en transcytose wegen.

Als bevestiging van onze cel model transepitheliaal transport gerichte NC bestuderen, Figuur 2 toont dat Caco-2 cel monolagen uitgeplaat bij een dichtheid van 1,5 x 10 5 cellen / cm 2 confluentie bereikten ~ Dag 12 en onderhouden monolaag integriteit tot dag 18, aangegeven TEER (Figuur 2A). Dit werd bevestigd door de aanwezigheid van occludin-positieve krappe kruispunten (Figuur 2B) in monolagen met hoge TEER (390 Ω × cm 2, Dag 14), in...

Watch this Scientific Journal Video about Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers at JoVE.com

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Vele therapeutische toepassingen vereisen een veilig en efficiënt transport van drugs vervoerders en hun lading over cellulaire barrières in het lichaam. Dit artikel beschrijft een aanpassing van bestaande methoden om de snelheid en het mechanisme van het vervoer van drugs nanocarriers (NC&#39;s) over cellulaire barrières, zoals de gastro-intestinale (GI) epitheel evalueren.

Modellen en methoden om vervoer van Drug Delivery Systems Across Cellular Barrières Evalueer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Bioengineering

Unit 1

Pharmacokinetics

SCIENTISTS IN ACTION

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bepaling van de Transport Rate van xenobiotica en nanomaterialen via de placenta met de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusie Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Fabricage en Drug Delivery Toepassingen van Silk Nanodeeltjes

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Een experimentele en Finite Element Protocol bij het vervoer van neutrale en geladen opgeloste stoffen over gewrichtskraakbeen Onderzoek

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Uitgebreide evaluatie van de effectiviteit en veiligheid van Placenta-gerichte Drug Delivery met behulp van drie aanvullende methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Injecteerbare supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor cel- en medicijnafgiftetoepassingen

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...