Name: models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers
Uploaded: 2013-10-17T19:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del Howard Hughes Medical Institute e la National Science Foundation per RG, e fondi erogati a SM dal National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) e l&#39;American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).

1. Coltivazione di un monostrato di cellule in Transwell Inserti <ol><li> In una sterile, livello di biosicurezza 2 cellule cappa cultura, pongono 0,8 millimetri poro PET Transwell inserisce in una piastra a 24 pozzetti (4 pozzi per condizione, per la significatività statistica) con una pinza. Tutti i materiali cofano, devono essere sterilizzati con etanolo. </li></ol> Nota: La dimensione dei pori del filtro deve essere selezionato in accordo alla dimensione media della NC utilizzato, per ...

<ol>
	<li>Deli, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+tight+junction+modulators+to+reversibly+open+membranous+barriers+and+improve+drug+delivery.">Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).</li><li>Mrsny, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+nature:+"Pathogen-Mimetic"+systems+for+mucosal+nano-medicines.">Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).</li><li>Turner, J. 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Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins.</a> Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).</li><li>Hughes, J., Crowe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+P-glycoprotein-mediated+efflux+of+digoxin+and+its+metabolites+by+macrolide+antibiotics.">Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics.</a> J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).</li><li>Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transepithelial+drug+transport+by+on-line+measurement:+cellular+control+of+paracellular+and+transcellular+transport.">In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport.</a> J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).</li><li>Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+from+molecular+mechanisms+to+therapeutics.">Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics.</a> Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).</li><li>Kapus, A., Szaszi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+apical+and+paracellular+transport+processes.">Coupling between apical and paracellular transport processes.</a> Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).</li><li>Hood, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+protection+by+PECAM-targeted+delivery+of+a+novel+NADPH-oxidase+inhibitor+to+the+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo.</a> J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).</li><li>Simone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+targeting+of+polymeric+nanoparticles+stably+labeled+with+the+PET+imaging+radioisotope+iodine-124.">Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124.</a> Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).</li><li>Vercauteren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li></ol>

Usando i metodi discussi sopra, un modello cellulare per studiare il trasporto di NC mirati attraverso le barriere cellulari può essere stabilita, come l&#39;esempio fornito per Caco-2 cellule epiteliali, che è rilevante per valutare trasporto dal lume GI nel sangue nel caso dei sistemi di drug delivery per via orale. Coltura di monostrati di cellule epiteliali GI in inserti transwell ha permesso la misurazione di TEER e fluorescenza immunoistochimica di giunzioni strette per confermare la formazione di una barriera d...

Barriere cellulari nell&#39;atto corpo come gateway tra l&#39;ambiente esterno e scomparti interni. Questo è il caso per il rivestimento epiteliale separa la superficie esterna esposta del tratto gastrointestinale (GI) e il flusso sanguigno 1-3. Barriere cellulari rappresentano anche l&#39;interfaccia tra il sangue e il parenchima e componenti cellulari di tessuti e organi. Questo è il caso per il rivestimento endoteliale interno in vasi sanguigni, come la barriera emato-polmonare, la barriera emato-encefalica, ecc 1 La capacità di attraversare le barriere cellulari nel corpo è cruciale per la consegna efficiente di agenti terapeutici e diagnostici in circolo e tessuti / organi in cui è necessario l&#39;intervento. Per migliorare l&#39;erogazione di agenti terapeutici o diagnostici, questi composti possono essere caricati in nanocarriers sub-micrometriche (NC). Questi veicoli di somministrazione di farmaci possono essere formulati con una varietà dichimiche e strutture per ottimizzare la solubilità della droga, la protezione, la farmacocinetica, il rilascio, e il metabolismo 4,5. NC può essere funzionalizzato con affinità o rivolti frazioni (ad esempio anticorpi, peptidi, aptameri zuccheri, ecc) per facilitare l&#39;adesione alle zone del corpo in cui è richiesta l&#39;azione terapeutica 2,6. Targeting di NC determinanti espresse sulla superficie delle barriere cellulari può facilitare il successivo trasporto in e / o di tutti questi rivestimenti 2,6. Il ruolo di trasportare selettivamente sostanze tra due ambienti richiede alcune caratteristiche uniche tra strati di cellule. Una tale funzionalità è polarità cellulare, per cui la membrana apicale rivolta verso il lume della cavità varia dalla membrana basolaterale orientata verso l&#39;interstizio tessuto, rispetto alla membrana morfologia e composizione dei lipidi, trasportatori e recettori 2. Un&#39;altra caratteristica comporta junctio intercellularens collegamento celle adiacenti. Regolazione delle proteine ​​che formano giunzioni strette, molecole di adesione particolarmente giunzionali (inceppamento), occludins e claudine, modulare la funzione di barriera per permettere selettivamente o non trasporto di sostanze tra cellule, note come trasporto paracellular, permettendo il passaggio di materiali dal lume a lo spazio basolaterale 3. Il legame di molti elementi naturali e sintetiche (leucociti, molecole, particelle e sistemi di drug delivery) alle barriere cellulari nel corpo può indurre apertura cella giunzione, che può essere transitoria e relativamente innocuo o più prolungato e, quindi, non sicuro con accesso di sostanze indesiderate attraverso la barriera 2,5,7-9. Di conseguenza, questa via può essere valutata misurando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e diffusione paracellular passiva di molecole (qui chiamato dispersione paracellular), per cui diminuita resistenza in corrente elettrica o maggiore dispersione paracellular di un inert composto nello spazio basolaterale indicare l&#39;apertura di giunzioni cellulari, rispettivamente 5,10,11. A complemento di questi metodi, una delle proteine ​​di giunzione stretti sopra elencati possono essere macchiati di valutare la loro integrità, dove la colorazione dovrebbe apparire concentrata ai confini cellula-cellula in tutto il periferia cellulare 5,10,12. In alternativa, sistemi di somministrazione di farmaci che hanno come target specifici determinanti della superficie cellulare, come quelli associati a fosse rivestite di clatrina o invaginazioni di membrana a fiasco chiamati caveole, possono innescare captazione vescicolare nelle cellule per endocitosi, fornendo una via per la somministrazione di farmaci a compartimenti intracellulari 5, 13. Inoltre, endocitosi può portare al traffico di vescicole in tutto il corpo cellulare per il rilascio sul lato basolaterale, un fenomeno noto come transyctosis, o il trasporto transcellulare 14. Pertanto, la conoscenza della cinetica e meccanismo di endocitosi può essere utilizzata per sfruttare intracellulare unand drug delivery transcellulare, che offre un modo relativamente sicuro e controllato di consegna rispetto alla via paracellular. (Endocitosi come nel caso della molecola di adesione cellulare (CAM)-mediata) Il meccanismo di endocitosi può essere valutata con modulatori dei percorsi classici (clatrina-e endocitosi caveolina-mediata, e macropinocitosi) o rotte non-classici 5,13,15 . Considerando traffico intracellulare è spesso studiato in pozzetti standard o coprioggetti, l&#39;assenza di un compartimento basolaterale osta polarizzazione cellulare e la capacità di studiare il trasporto attraverso strati di cellule. Per superare questo ostacolo, il trasporto attraverso monostrati cellulari sono stati a lungo studiati utilizzando transwell inserti 10,11,16,17, che consistono in un (apicale) camera superiore, una membrana permeabile poroso in cui le cellule si attaccano e formano un monostrato stretto, ed una inferiore (basolaterale) camera (Figura 1). In questa configurazione, il trasporto può essere misurata nelapicale a basolaterale direzione somministrando un trattamento nella camera superiore, segue un percorso attraverso il monostrato cellulare e la membrana porosa sottostante, e finalmente raccogliendo il mezzo nella camera inferiore per la quantificazione del materiale trasportato. Trasporto in direzione basolaterale-to-apicale può anche essere misurata mediante somministrazione iniziale alla camera inferiore e successiva raccolta dalla camera superiore 5,10,12,16. Esistono varie tecniche per verificare la formazione di permeabilità barriera su transwells, compresi TEER e saggi trasporto paracellular, come descritto sopra. Inoltre, il filtro permeabile in cui le cellule sono coltivate può essere rimosso per l&#39;analisi delle immagini (ad esempio mediante fluorescenza, confocale, microscopia elettronica), come ulteriormente validazione del modello monostrato cellulare così come il meccanismo di trasporto. Selezione del tipo a membrana, che è disponibile in diverse dimensioni dei pori, materiali e superfici, in funzione di varie factors come la dimensione di sostanze o oggetti da trasportare, tipo cellulare, e metodo di imaging 16,18-20. Transwell inserti anche facilitare quantificazione controllato e preciso di trasporto rispetto ai sistemi complessi di mammifero, come volumi delle camere e della superficie cellulare sono costanti note. Mentre molti fattori coinvolti nella consegna in vivo sono eliminati, tra cui la presenza di muco intestinale, shear stress, enzimi digestivi, le cellule immunitarie, ecc, questa piccola scala modello in vitro fornisce informazioni preliminari utili in materia di trasporti. Come esempio per illustrare l&#39;adattamento di questi metodi per studiare il trasporto NC attraverso le barriere cellulari 10,11,16,17, descriviamo qui un caso in cui il rischio di propagazione NC attraverso l&#39;epitelio GI stato modellato valutando passaggio di un drug delivery modello sistema attraverso un monostrato di adenocarcinoma colorettale epiteliale umano (Caco-2) cellule. A tal fine, cells stati coltivati ​​in inserti transwell, su un 0,8 micron pori polietilene tereftalato (PET) filtro (diametro 6,4 mm), che è trasparente e può essere utilizzato per l&#39;imaging microscopia. Lo stato della barriera di permeabilità è convalidata misurando TEER, trasporto apicale a basolaterale di una sostanza di riferimento, albumina, e visualizzazione microscopia a fluorescenza di un elemento delle giunzioni strette, proteine ​​occludina. Un modello di polimero mirata NC viene utilizzato, costituito da 100 nm, nanoparticelle polistirene non biodegradabile. NC sono rivestiti mediante adsorbimento superficie con un anticorpo rivolti solo o una combinazione di un anticorpo targeting e un carico terapeutico, in cui o componente può essere marcato con 125 I per radioisotopo tracciamento. Nell&#39;esempio selezionata, l&#39;anticorpo riconosce molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), una proteina espressa sulla superficie di GI epiteliale (e altre cellule), che è stato dimostrato per facilitare il trasporto intracellulare e transcellulare o<html> trasportatori di farmaci f e del loro carico 21. Il carico è l&#39;alfa-galattosidasi (α-Gal), un enzima terapeutico usato per il trattamento della malattia di Fabry, una malattia da accumulo lisosomiale genetica 22. NCS rivestiti, di circa 200 nm dimensioni, vengono aggiunti alla camera apicale sopra il monostrato cellulare e incubate a 37 ° C per vari periodi di tempo, dopo che 125 I sulla NC può essere rilevato associata al monostrato di cellule e / o trasportato alla camera basolaterale sotto le celle. Ulteriori determinazione del libero 125 mi permette di sottrazione della frazione degradato e la stima dei trasporti rivestito NC. Il meccanismo di trasporto è ulteriormente valutata esaminando cambiamenti nella permeabilità della barriera di pertinenza del percorso paracellulare, attraverso i parametri sopra descritti, mentre il trasporto transcellulare è determinata esaminando cambiamenti nel trasporto modulando vie di endocitosi e transcitosi. ONTENUTO &quot;&gt; Questi metodi forniscono informazioni preziose riguardo modelli barriera cellulare, il grado e la velocità di trasporto di un sistema di somministrazione di farmaci, e il meccanismo di tale trasporto, consentendo complessivamente valutazione del potenziale per la somministrazione di farmaci attraverso le barriere cellulari.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

Vettori sub-micrometriche (nanovettori; NC) migliorare l&#39;efficacia dei farmaci, migliorando la solubilità, stabilità, tempo di circolazione, il targeting e il rilascio. Inoltre, attraversando le barriere cellulari nel corpo è fondamentale sia per la somministrazione orale di NC terapeutici nella circolazione e il trasporto dal sangue nei tessuti, dove è necessario un intervento. NC trasporto attraverso le barriere cellulari si ottiene: (i) il percorso paracellulare, via transitoria interruzione delle giunzioni che si incastrano celle adiacenti, o (ii) il percorso transcellulare, in cui i materiali vengono internalizzati per endocitosi, trasportato attraverso il corpo cellulare, e secreta sulla superficie cellulare opposta (transyctosis). Consegna attraverso le barriere cellulari può essere facilitata con l&#39;accoppiamento di terapie o loro vettori con agenti di targeting che si legano specificamente a marcatori di superficie cellulare coinvolti nel trasporto. Qui, forniamo i metodi per misurare l&#39;entità e il meccanismo di trasporto NC attraverso una barriera cellulare modello, which è costituito da un monostrato di gastrointestinale (GI), le cellule epiteliali coltivate su una membrana porosa situato in un inserto transwell. Formazione di una barriera di permeabilità è confermata dalla misurazione resistenza elettrica transepiteliale (TEER), trasporto transepiteliale di una sostanza di riferimento, e immunocolorazione delle giunzioni strette. Come esempio, si usano ~ 200 nm NC polimeriche, che portano un carico terapeutica e rivestite con un anticorpo che si rivolge a un determinante superficie cellulare. L&#39;anticorpo o un carico terapeutica è etichettato con 125 I per radioisotopo rintracciamento e NC etichettati vengono aggiunti alla camera superiore sopra il monostrato cellulare per diversi periodi di tempo. NC associati alle cellule e / o trasportati alla camera sottostante può essere rilevato. Misurazione della libera 125 I consente la sottrazione della frazione degradato. Il percorso paracellulare è valutata determinando potenziali variazioni causate dal trasporto NC barriera ai parametri sopra descritti. Transcellulare i trasportis determinata affrontando l&#39;effetto di modulare endocitosi e transcitosi percorsi.

Come validazione del nostro modello cellulare per lo studio trasporto transepiteliale di CN mirati, la figura 2 mostra che Caco-2 monostrati di cellule piastrate ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule / cm 2 raggiunto confluenza ~ 12 ° giorno e mantenuti integrità monostrato fino al giorno 18, indicato con TEER (Figura 2A). Questo è stato convalidato dalla presenza di giunzioni strette occludina-positivi (Figura 2B) in monostrati con elevata TEER...

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Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Molte applicazioni terapeutiche richiedono un trasporto sicuro ed efficiente dei vettori della droga e dei loro carichi attraverso le barriere cellulari nel corpo. Questo articolo descrive un adattamento di metodi consolidati per valutare il tasso e il meccanismo di trasporto di nanocarriers droga (NCS) attraverso le barriere cellulari, come il tratto gastrointestinale (GI) epitelio.

Modelli e metodi per valutare il trasporto di Drug Delivery Systems attraverso le barriere cellulari

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

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