Name: models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers
Uploaded: 2013-10-17T19:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et fellesskap av Howard Hughes Medical Institute og National Science Foundation til RG, og midler tildelt til SM ved National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) og American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).

En. Dyrkning en celle med ett lag i Transwell Setter <ol><li> I et sterilt, biosikkerhet nivå to cellekultur hette, legg 0,8 mm pore PET Transwell inserts inn i en 24-brønns plate (4 brønner per tilstand, for statistisk signifikans) med tang. Alle materialer som går panseret bør steriliseres med etanol. </li></ol> Merk: Porestørrelsen av filteret må velges i samsvar med gjennomsnittsstørrelsen av NC anvendes, for å tillate transport over membranen. Også for statistisk signifikante...

<ol>
	<li>Deli, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+tight+junction+modulators+to+reversibly+open+membranous+barriers+and+improve+drug+delivery.">Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).</li><li>Mrsny, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+nature:+"Pathogen-Mimetic"+systems+for+mucosal+nano-medicines.">Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+and+stimuli-sensitive+pharmaceutical+nanocarriers.">Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).</li><li>Sadekar, S., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+transport+and+toxicity+of+PAMAM+dendrimers:+implications+for+oral+drug+delivery.">Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).</li><li>Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+design+and+characterization+of+ligand-targeted+drug+delivery+systems.">Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems.</a> J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).</li><li>Volkheimer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persorption+of+particles:+physiology+and+pharmacology.">Persorption of particles: physiology and pharmacology.</a> Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).</li><li>Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cell+junctions:+happy+together.">Endothelial cell-cell junctions: happy together.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).</li><li>Jung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+oral+delivery+of+peptides:+is+there+a+role+for+polymers+to+affect+mucosal+uptake.">Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).</li><li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers.">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li><li>Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+epithelial+cell+culture+in+studies+of+drug+transport.">Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport.</a> Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).</li><li>Bareford, L. M., Swaan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+mechanisms+for+targeted+drug+delivery.">Endocytic mechanisms for targeted drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).</li><li>Tuma, P. L., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcytosis:+crossing+cellular+barriers.">Transcytosis: crossing cellular barriers.</a> Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).</li><li>Muro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocytic+pathway+induced+by+clustering+endothelial+ICAM-1+or+PECAM-1.">A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1.</a> J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).</li><li>Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Caco-2+cell+monolayers+in+prediction+of+intestinal+drug+absorption.">Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption.</a> Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).</li><li>Delie, F., Rubas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colonic+cell+line+sharing+similarities+with+enterocytes+as+a+model+to+examine+oral+absorption:+advantages+and+limitations+of+the+Caco-2+model.">A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model.</a> Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).</li><li>Kuhnline Sloan, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+and+biological+methods+for+probing+the+blood-brain+barrier.">Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).</li><li>Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional,+all-human+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+using+mono-,+co-,+and+tri-cultivation+Transwell+models.">Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models.</a> J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).</li><li>Kasper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flotillin-involved+uptake+of+silica+nanoparticles+and+responses+of+an+alveolar-capillary+barrier+in+vitro.">Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).</li><li>Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+nanocarriers+across+gastrointestinal+epithelial+cells+by+a+new+transcellular+route+induced+by+targeting+ICAM-1.">Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1.</a> J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).</li><li>Hsu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+endothelial+delivery+and+biochemical+effects+of+alpha-galactosidase+by+ICAM-1-targeted+nanocarriers+for+Fabry+disease.">Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease.</a> J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).</li><li>Schmiedlin-Ren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+enhanced+oral+availability+of+CYP3A4+substrates+by+grapefruit+constituents.+Decreased+enterocyte+CYP3A4+concentration+and+mechanism-based+inactivation+by+furanocoumarins.">Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins.</a> Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).</li><li>Hughes, J., Crowe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+P-glycoprotein-mediated+efflux+of+digoxin+and+its+metabolites+by+macrolide+antibiotics.">Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics.</a> J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).</li><li>Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transepithelial+drug+transport+by+on-line+measurement:+cellular+control+of+paracellular+and+transcellular+transport.">In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport.</a> J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).</li><li>Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+from+molecular+mechanisms+to+therapeutics.">Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics.</a> Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).</li><li>Kapus, A., Szaszi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+apical+and+paracellular+transport+processes.">Coupling between apical and paracellular transport processes.</a> Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).</li><li>Hood, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+protection+by+PECAM-targeted+delivery+of+a+novel+NADPH-oxidase+inhibitor+to+the+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo.</a> J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).</li><li>Simone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+targeting+of+polymeric+nanoparticles+stably+labeled+with+the+PET+imaging+radioisotope+iodine-124.">Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124.</a> Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).</li><li>Vercauteren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li></ol>

Ved hjelp av de metoder som er omtalt ovenfor, kan en cellemodell for å studere transport av målrettede norsk sokkel på tvers av cellebarrierer bli etablert, slik som eksemplet gitt for Caco-2 epitelceller, som er relevante for å evaluere transport fra GI lumen inn i blod i det tilfellet orale medikamentleveringssystemer. Dyrking av GI epitelial cellemonolagene i Transwell inserts aktivert måling av Teer og fluorescens farging av trange veikryss for å bekrefte dannelsen av en celle permeabilitet barriere. Senere, ...

Cellular barrierer i kroppen fungerer som en gateway mellom det ytre miljøet og interne avdelinger. Dette er tilfellet for den epiteliale foring skille eksternt eksponert overflate av gastrointestinal (GI)-tarmkanalen og i blodet til 1-3. Cellular barrierer representerer også grenseflaten mellom blodet og parenchyma og cellulære komponenter av vev og organer. Dette er tilfelle for den indre endotelial foring i blodkar, slik som blod-lunge-barrieren, blod-hjerne-barrieren, etc. 1. Evnen til å passere disse cellulære barrierer i kroppen er avgjørende for effektiv levering av terapeutiske og diagnostiske midler inn i sirkulasjon og vev / organer der intervensjon er nødvendig. For å forbedre levering av terapeutiske eller diagnostiske midler, kan disse forbindelsene bli lastet inn i sub-mikrometer nanocarriers (NCS). Disse narkotika levering kjøretøy kan formuleres med en rekkekjemi og strukturer for å optimalisere narkotika oppløselighet, beskyttelse, farmakokinetikk, utgivelse, og metabolisme 4,5. NCs kan også bli functionalized med affinitet eller målretting moieties (f.eks antistoffer, peptider sukker, aptamers, etc.) for å lette vedheft til områder av kroppen der det terapeutiske tiltak kreves 2,6. Målretting NCS for å uttrykkes på overflaten av cellebarrierer kan videre legge til rette for transport inn i og / eller på tvers av disse pakninger 2,6. Rollen til selektivt å transportere stoffer mellom to miljøer krever visse unike egenskaper blant cellelag. En slik funksjon er celle polaritet, hvorved den apikale membran som vender mot hulrommet i hulrom varierer fra basolateral membran orientert mot vevet interstitium, med hensyn til membran morfologi og sammensetning av lipider, transportører, og reseptorer 2. En annen funksjon innebærer inter Junctions forbinder tilstøtende celler. Regulering av de proteiner som danner trange veikryss, særlig junksjonale adhesjonsmolekyler (syltetøy), occludins og Claudins, modulere barrierefunksjon for selektivt å tillate eller ikke transport av stoffer mellom celler, kjent som paracellular transport, slik at passasje av materialer fra hulrommet til den basolateral plass tre. Binding av mange naturlige og syntetiske elementer (leukocytter, molekyler, partikler og medikamentleveringssystemer) til cellebarrierer i kroppen kan indusere celle-koplingsåpning, som kan være forbigående og relativt ufarlige eller mer langvarig og derfor usikre med tilgang av uønskede stoffer over barrieren 2,5,7-9. Følgelig kan denne veien bedømmes ved å måle transepithelial elektrisk motstand (teer) og passiv paracellular diffusjon av molekyler (heretter kalt paracellular lekkasje), hvorved redusert motstand mot en elektrisk strøm eller økt paracellular lekkasje av en inert sammensatte inn i basolateral plass indikere åpning av celle veikryss, henholdsvis 5,10,11. For å komplettere disse metodene, kan noen av de trange veikryss proteiner nevnt ovenfor være farget for å vurdere deres integritet, hvor flekker bør vises konsentrert på celle-cellekant hele cellen periferien 5,10,12. Alternativt, kan stoffet leveringssystemer som er rettet mot spesifikke celleoverflate determinanter, for eksempel de som er knyttet til clathrin-coated pits eller kolbeformet membran invaginations kalt caveolae, utløse vesicular opptak i cellene ved endocytose, som gir en vei for levering av legemidler til intracellulære rom 5, 13. I tillegg kan endocytose føre til smugling av vesikler over hele cellen kroppen for utgivelse på basolateral side, et fenomen kjent som transyctosis, eller transcellular transport 14. Derfor kan kjennskap til kinetikk og mekanismen for endocytose brukes til å utnytte en intracellulærnd transcellular levering av legemidler, som tilbyr et relativt trygt og kontrollert modus for levering i forhold til paracellular rute. Mekanismen for endocytose kan evalueres med modulatorer av klassiske baner (clathrin-og caveolin endocytose, og macropinocytosis) eller ikke-klassiske veier (for eksempel tilfellet med celleadhesjonsmolekyl (CAM)-mediert endocytose) 5,13,15 . Mens intracellulær trafikkering blir ofte undersøkt i standard brønner eller dekkglass, i fravær av en basolateral kammer utelukker cellepolarisering og evnen til å studere transport over cellelagene. For å overvinne denne hindring, har transport over celle-monolag lenge vært undersøkt ved hjelp av Transwell setter 10,11,16,17, som består av en øvre (apikal) kammer, en porøs permeabel membran, hvor cellene feste og danner et tett monosjikt, og et nedre (basolateral) kammer (figur 1). I denne konfigurasjonen, transport kan måles iapikal-til-basolateral retning ved administrering av en behandlings inn i det øvre kammer, etter transport gjennom cellemonolaget og den underliggende porøse membranen, og til slutt å samle mediet i det nedre kammeret for kvantifisering av transportert materiale. Transport i basolateral-til-apikal retningen kan også måles ved innledende administrering til det nedre kammer og påfølgende samling fra det øvre kammer 5,10,12,16. Forskjellige teknikker eksisterer for å bekrefte dannelsen av permeabilitet barriere på transwells, inkludert teer og paracellular transport-analyser, som beskrevet ovenfor. Dessuten kan det permeable filter som cellene dyrkes fjernes for avbildningsanalyse (for eksempel ved fluorescens, konfokal, elektronmikroskopi), som ytterligere kontroll av cellemonolaget modellen, samt mekanismen for transport. Valg av membran-type, som er tilgjengelig i forskjellige pore-størrelser, materialer og overflatearealer, er avhengig av en rekke factors slik som størrelsen av stoffer eller gjenstander som skal transporteres, celletype, og fremgangsmåte for billeddannelse 16,18-20. Transwell innsatser også lette kontrollert og nøyaktig kvantifisering av transport sammenlignet med komplekse pattedyrsystemer, som volumene av kamrene og celleoverflate er kjente konstanter. Selv om mange faktorer som er involvert i tilførsel in vivo er eliminert, blant annet nærværet av intestinale slim, skjærspenning, fordøyelsesenzymer, immunceller, etc., den lille målestokk in vitro-modell gir nyttig innledende informasjon vedrørende transport. Som et eksempel for å illustrere tilpasning av disse metodene for å studere NC transport over mobilnettet barrierer 10,11,16,17, beskriver vi her et tilfelle hvor potensialet for NC transport over GI epitel ble modellert ved å vurdere passering av en modell for levering av legemidler systemet gjennom et monolag av human epitelial kolorektal adenokarsinom (Caco-2) celler. For dette formålet, calen ble dyrket i Transwell innlegg, på en 0,8 um pore polyetylen-tereftalat (PET) filter (6,4 mm diameter), som er gjennomsiktig og kan brukes for mikros avbildning. Statusen til permeabilitet barrieren er validert ved å måle teer, apikal-til-basolateral transport av en styre substans, albumin, og fluorescensmikroskopi visualisering av et element av den trange veikryss, occludin protein. En modell av målrettet polymer NC benyttes, som består av 100 nm, ikke biologisk nedbrytbar polystyren nanopartikler. Norsk sokkel er belagt med overflate adsorpsjon med en målsøkende antistoff alene eller en kombinasjon av en målsøkende antistoff og et terapeutisk last, hvor noen av komponentene kan være merket med 125I for radioisotop tracing. I det valgte eksempel gjenkjenner antistoffet intercellulære adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1), et protein som uttrykkes på overflaten av GI epithelial (og andre) celler, som er blitt vist for å forenkle intracellulære og transcellular transport o<html> f narkotika bærere og deres last 21. Lasten er alfa-Galactosidase (α-Gal), et terapeutisk enzym som brukes for behandling av Fabrys sykdom, en genetisk lysosomal lagringsforstyrrelse 22.. De belagte sokkelen på ca 200 nm i størrelse, tilsettes til den apikale kammeret over cellemonolaget og inkubert ved 37 ° C i varierende tidsperioder, hvoretter 125. I på norsk sokkel kan detekteres forbundet til cellemonolaget og / eller transporteres til basolateral kammeret under cellene. Ytterligere bestemmelse av fri 125I tillater subtraksjon av det degraderte fraksjon og estimering av belagt NC transport. Mekanismen for transport er videre undersøkt ved å studere forandringer i permeabiliteten barriere med hensyn til paracellular rute, gjennom parameterne som er beskrevet ovenfor, mens transcellular transport blir bestemt ved å undersøke forandringer i transport når moduler veier av endocytose og transcytosis. ontent &quot;&gt; Disse metoder gir verdifull informasjon angående cellulær barrieremodeller, grad og hastighet for transport av en medikamentavgivelsessystem, og mekanismen for slik transport, til sammen tillater evaluering av potensialet for levering av legemidler over cellebarrierer.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

Sub-mikrometer bærere (nanocarriers; NCS) forbedre effekten av legemidler ved å forbedre oppløselighet, stabilitet, sirkulasjon tid, målretting, og slipp. I tillegg krysser cellulære barrierer i kroppen er av betydning både for oral levering av terapeutiske NCS inn i sirkulasjonen og transport fra blodet inn i vevet, hvor intervensjon er nødvendig. NC transport gjennom cellebarrierer er oppnådd ved: (i) paracellular rute, via forbigående avbrudd i knutepunktene som sammen tilstøtende celler, eller (ii) den transcellular rute, hvor materialene er internalisert ved endocytose, transporteres på tvers av cellelegemet, og skilles ved den motsatte celleoverflaten (transyctosis). Levering over mobilnettet barrierer kan gjøres lettere ved å koble legemiddelselskap eller deres bærere med målretting midler som binder spesifikt til celle-overflate markører som er involvert i transport. Her gir vi fremgangsmåter for å måle graden og mekanismen for NC transport over en modell cellebarriere, noe som tilsvarerch består av et monosjikt av gastrointestinal (GI) epitelceller dyrket på en porøs membran som ligger i et Transwell innsats. Dannelse av en permeabilitet barriere er bekreftet ved å måle transepithelial elektrisk motstand (Teer), transepithelial transport av en kontroll substans, og farging av trange veikryss. Som et eksempel, ~ 200 nm polymer norsk sokkel brukt, som bærer en terapeutisk last og er belagt med et antistoff som er rettet mot et celleoverflate determinant. Antistoffet eller terapeutisk lasten er merket med 125I for radioisotop sporing og merkede sokkelen tilsatt til det øvre kammer over cellen monolag etter varierende tidsperioder. Norsk sokkel forbundet til cellene og / eller transportert til det underliggende kammer kan detekteres. Måling av frie 125. I lar subtraksjon av det degraderte fraksjon. Den paracellular ruten blir vurdert ved å bestemme eventuelle endringer forårsaket av NC transport til barriere parametre som er beskrevet ovenfor. Transcellular transport is bestemmes ved å ta virkningen av å modulere endocytose og transcytosis trasé.

Som validering av vår celle modell for å studere transepithelial transport av målrettede NCs, Figur 2 viser at Caco-2 celle monolayers belagt med en tetthet på 1,5 × 10 5 celler / cm 2 nådde samløpet ~ Dag 12 og vedlikeholdt monolayer integritet opp til dag 18, angitt med Teer (Figur 2A). Dette ble bekreftet ved tilstedeværelse av occludin-positive tett veikryss (figur 2B) i monolag med høy teer (390 Ω x cm 2, dag 14), sammenli...

Watch this Scientific Journal Video about Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers at JoVE.com

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Mange terapeutiske applikasjoner krever sikker og effektiv transport av legemiddelbærer og den last på tvers av cellebarrierer i kroppen. Denne artikkelen beskriver en tilpasning av etablerte metoder for å vurdere raten og mekanismen for transport av stoffet nanocarriers (NCS) på tvers av cellebarrierer, slik som gastrointestinal (GI) epitel.

Modeller og metoder for å vurdere transport av Drug Delivery Systems Across Cellular Barrierer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Bioengineering

Unit 1

Pharmacokinetics

SCIENTISTS IN ACTION

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Fastsettelse av Transport Valuta xenobiotics og nanomaterialer over placenta ved hjelp<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menneskelig placentaperfusjon Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Egenrapportering Stillaser for 3-dimensjonal Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Produksjon og levering av legemidler Anvendelser av Silk Nanopartikler

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En eksperimentell og Finite Element-protokollen for å undersøke Transport av nøytrale og siktet Oppløste stoffer over Leddbrusk

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Overflate Functionalization av hepatitt E Virus nanopartikler bruke kjemiske Bøyning

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattende evaluering av effektiviteten og sikkerheten til morkaken målrettede narkotika-leveranser med tre komplementære metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Repressing Gene transkripsjon av omadresserer cellulære maskiner med kjemiske Epigenetic modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

3D-analyse av multi-Cellular Svar å Chemoattractant graderinger

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Formulere og karakterisere Lipid nanopartikler for genlevering ved hjelp av en mikrofluidisk blandeplattform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Injiserbare supramolecular polymer-nanopartikkel hydrogeler for celle- og legemiddelleveringsapplikasjoner

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...