Name: promotion of survival and differentiation of neural stem cells with fibrin and growth factor cocktails after severe spinal cord injury
Uploaded: 2014-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury at JoVE.com

Wij danken de Rat Resource and Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, voor het verstrekken van GFP ratten; Neuralstem Inc verschaffen van humane neurale stamcellen. Dit werk werd ondersteund door de Veterans Administration, NIH (NS09881), Canadese Spinal Research Organization, The Craig H. Neilsen Foundation en de Bernard en Anne Spitzer Charitable Trust.

Alle dierlijke protocollen worden goedgekeurd door VA-San Diego Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). NIH richtlijnen voor proefdier zorg en veiligheid worden strikt opgevolgd. Dieren hebben vrije toegang tot voedsel en water gedurende de studie en adequaat worden behandeld voor het minimaliseren van pijn en ongemak. 1. Voorbereiding van fibrine onderdelen die Growth Factor Cocktails <ol><li> Los 25 mg rat fibrinogeen in 0,5 ml PBS tot 50 mg / ml 2x voorraad oplossing te ver...

<ol>
	<li>Ramon y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Degeneration+and+regeneration+of+the+nerve+system.">In Degeneration and regeneration of the nerve system.</a> , (1991).</li><li>Jakeman, L. B., Reier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+projections+between+fetal+spinal+cord+transplants+and+the+adult+rat+spinal+cord:+a+neuroanatomical+tracing+study+of+local+interactions.">Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions.</a> J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).</li><li>Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+spinal+cord+tissue+in+mini-guidance+channels+promotes+longitudinal+axonal+growth+after+grafting+into+hemisected+adult+rat+spinal+cords.">Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords.</a> Neural Plast. 6, 103-121 (1999).</li><li>Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+growth+and+fate+of+fetal+spinal+iso-+and+allografts+in+the+adult+rat+injured+spinal+cord.">Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord.</a> Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).</li><li>Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+fetal+spinal+cord+grafts+in+the+adult+rat+spinal+cord:+influences+of+lesion+and+grafting+conditions.">Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions.</a> Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).</li><li>Wictorin, K., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+outgrowth+from+grafts+of+human+embryonic+spinal+cord+in+the+lesioned+adult+rat+spinal+cord.">Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord.</a> Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).</li><li>Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+progenitor+cell+grafts+survive+after+acute+spinal+cord+injury+and+integrate+along+axonal+pathways.">Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways.</a> Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).</li><li>Blits, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector-mediated+transduction+of+neural+progenitor+cells+before+implantation+into+injured+spinal+cord+and+brain+to+detect+their+migration,+deliver+neurotrophic+factors+and+repair+tissue.">Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue.</a> Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).</li><li>Lepore, A. C., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-restricted+neural+precursors+survive,+migrate,+and+differentiate+following+transplantation+into+the+injured+adult+spinal+cord.">Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord.</a> Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).</li><li>Gaillard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+damaged+adult+motor+pathways+by+grafted+embryonic+cortical+neurons.">Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons.</a> Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+lines+of+GFP+transgenic+rats+relevant+for+regenerative+medicine+and+gene+therapy.">New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy.</a> Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).</li><li>Cao, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+engrafted+into+the+normal+or+lesioned+adult+rat+spinal+cord+are+restricted+to+a+glial+lineage.">Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage.</a> Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).</li><li>Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+spinal+cord+stem/progenitor+cells+transplanted+as+neurospheres+preferentially+differentiate+into+oligodendrocytes+in+the+adult+rat+spinal+cord.">Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord.</a> Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).</li><li>Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+detection+and+identification+of+multiple+chromosomal+integration+sites+in+transgenic+animals+created+with+lentivirus.">Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus.</a> Biotechniques. 41, 715-719 (2006).</li><li>Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+soluble+growth+factors+on+embryonic+stem+cell+differentiation+inside+of+fibrin+scaffolds.">The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds.</a> Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).</li><li>Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+improve+motoneuron+survival+and+function+of+muscle+reinnervated+by+embryonic+neurons.">Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).</li><li>Kadoya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+intrinsic+and+extrinsic+neuronal+mechanisms+facilitate+bridging+axonal+regeneration+one+year+after+spinal+cord+injury.">Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury.</a> Neuron. 64, 165-172 (2009).</li><li>Lu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+growth+and+connectivity+of+neural+stem+cells+after+severe+spinal+cord+injury.">Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury.</a> Cell. 150, 1264-1273 (2012).</li><li>Coumans, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+complete+spinal+cord+transection+in+rats+by+delayed+treatment+with+transplants+and+neurotrophins.">Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins.</a> J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).</li><li>Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+e18+cortical+rat+neurons+for+compartmentalization+in+a+microfluidic+device.">Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device.</a> J Vis Exp. (305), (2007).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+neuronal+differentiation+of+human+neural+stem+cell+grafts+in+adult+rat+spinal+cord.">Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord.</a> PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).</li><li>Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+bridges+for+spinal+cord+repair.">Building bridges for spinal cord repair.</a> Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).</li><li>Catelas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin.">Fibrin.</a> Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).</li><li>Petter-Puchner, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+neurocompatibility+of+human+fibrin+sealant+and+equine+collagen+as+biomatrices+in+experimental+spinal+cord+injury.">The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury.</a> Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Deister, C., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neurotrophic+factor+combinations+for+neurite+outgrowth.">Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth.</a> Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).</li></ol>

Een van de belangrijkste hindernissen voor NSC transplantatie in het ruggemerg slecht overleving in de laesie centrum. Eventuele lacunes of holten in de laesie zou kunnen verminderen of verzwakken de vorming van functionele neuronale relais tussen supraspinale axonen en gescheiden ruggenmergsegmenten onder het letsel. Bovendien kan een slechte overleving van geënte NSCs hun integratie met gastheer weefsel beïnvloeden, en dus verminderen connectiviteit van geënt neuronen met de ontvangende neuronen. Mogelijke mechanis...

Ruggenmergletsel (SCI) vaak schade niet alleen witte stof traktaten die signalen vervoeren van en naar de hersenen, maar ook de centrale grijze stof, waardoor segmentale verlies van interneuronen en motorische neuronen. Het gevolg van SCI is het verlies van zowel motorische en sensorische functie onder de laesie. Helaas heeft het volwassen centraal zenuwstelsel (CZS) niet spontaan regenereren, waardoor permanente functionele tekorten 1. Daarom reconstructie van het ruggenmerg gewonde volwassen en verbetering van de motorische, sensorische en autonome functie is een belangrijk doel van SCI onderzoek. Neurale stamcellen (NSC), hetzij direct geïsoleerd van embryonale of volwassen CZS, zijn dwingend kandidaat cellen om verloren neuronen en gliacellen te vervangen. Bovendien zijn deze cellen de potentie om nieuwe functionele relais te vormen om axonale geleiding door een laesie 2,3 herstellen. Tot op heden is er geen gedetailleerde toelichting van de anatomische, electrophys geweestiological en gedragseffecten van neuronale relais vorming door getransplanteerde NSC na ernstige SCI. Er zijn verschillende redenen voor: ten eerste, getransplanteerde NSCs of foetale CNS weefsel overleven slecht wanneer geënt op grote laesie holtes. Eerdere studies tonen aanzienlijke vroege cel verlies, waardoor grote lege cystic laesie holten 4,5. In sommige studies zou de geënte cellen vervolgens verdelen en vullen de laesie holte van 4,5, maar dit kan later een vertraging van dagen tot weken en vervolgens laesie vulling misschien niet volledig of consistent zijn. Ten tweede, een efficiënte tracking systeem dat correcte gegevens op cellulaire overleving, differentiatie / rijping, en uitgroei van getransplanteerde NSCs biedt ontbrak. De meeste vroege studies gebruikt antegrade en retrograde etikettering axonale projecties van transplantaties 2,3 traceren. Echter, deze technieken slechts gedeeltelijk en vaak onduidelijk gelabelde axonale projecties die voortvloeien uit geënte cellen en tracer methoden zijn subjectievet artefacten veroorzaakt door kleurstof lekkage voorbij de geïmplanteerde cellen. Andere groepen gebruikt humaan specifieke neuronale markers om axonale projecties na transplantatie van menselijke foetale NSCs in gewonden knaagdier ruggenmerg 5,6 labelen. Echter, in die studies, de xenotransplantaten niet consequent goed overleven. Onlangs, virale aflevering van het GFP reportergen werd gebruikt om gekweekte NSCs 7,8 labelen. Echter, was GFP expressie vaak inconsistent en kan worden downgereguleerd 7. Onlangs is het gebruik van transgene donor muizen of ratten op stabiele wijze het reportergen GFP of de menselijke placenta alkalische fosfatase, is sterk verbeterd het volgen van getransplanteerde neurale stamcellen / voorlopercellen in vivo 9,11. Ten derde, een aantal studies blijkt dat in vitro gekweekte rat NSCs verkregen uit embryonale of volwassen CZS uitsluitend differentiëren in gliacellen geslachten wanneer getransplanteerd in het milieu van de wervelkolom cor intact of gewonde volwassend 7,12,13, hoewel deze neurale stamcellen kunnen differentiëren tot neuronen en glia zowel in vitro, wat aangeeft dat lokale omgeving het lot van stamcellen dicteren. Alternatief kan gekweekt NSCs, met name afkomstig uit volwassen CZS, defaulty intrinsieke eigenschap te differentiëren in gliale lineages in vivo 13. Vanwege de beperkingen hierboven besproken, heeft onze groep recent een nieuw protocol ontwikkeld om embryonale NSC tracking, de overleving en differentiatie / rijping in de ernstig gewonde volwassen ruggenmerg verbeteren. Samengevat, zijn we begonnen met een stabiele transgene Fischer 344 ratten inteelt lijn uitdrukken van een GFP reporter gen dat GFP expressie in stand houdt na in vivo transplantatie 14. Vervolgens gebruikten we vers geïsoleerde NSCs uit embryonale dag 14 Fischer 344 ruggenmerg, een stadium van ontwikkeling die het potentieel om zowel neuronen en gliacellen genereren behoudt. Ten slotte hebben we ingebednet losgemaakte NSCs in een fibrine matrix met groeifactoren 15-17 om de cellen te behouden en gelijkmatig te verspreiden binnen een grote laesie holte, gericht op het transplantaat overleving van de cel, differentiatie en integratie te ondersteunen. Transplantaten werden geplaatst in locaties van T3 volledige doorsnijding, twee weken na dwarslaesie. Deze geënte cellen consequent gevuld volledige doorsnijding sites en gedifferentieerd in voorkomende neuronen dat grote aantallen axonen uitgebreid naar gastheer ruggenmerg over lange afstanden 18. Soortgelijke resultaten werden verkregen met gekweekte menselijke neurale stamcel transplantaten immuno-deficiënte ratten 18.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibrinogen(rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F6755-25MG</td>
 <td>2 hr at 37 &deg;C to dissovle 
 Stock Concentration: 50 mg/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thrombin (rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T5772-100UN</td>
 <td>Dissovle in 10 mM CaCl2 
 Stock Concentration: 50 U/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F0291 (25 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGF (murine)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>E1257 (0.1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDNF(human)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>452-02 (1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 1000 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 50 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT-3 (human)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>452-03 (1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 1000 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 50 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GDNF (rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G1401 (10 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IGF-1(mouse)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>I8779 (50 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>aFGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F5542 (25 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PDGF-AA (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3076 (10 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H9661 (5 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MDL28170</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M6690 (25 mg)</td>
 <td>Stock in DMSO 
 Stock Concentration: 1 mM 
 Final Concentration: 50 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>BSS-1005-B</td>
 <td>Stock Concentration: 1X 
 Final Concentration: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine</td>
 <td>Putney</td>
 <td>26637-411-01</td>
 <td>40-80 mg/kg 
 Stock Concentration: 100 mg/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylazine</td>
 <td>Lloyd</td>
 <td>0410,</td>
 <td>2.5-8 mg/ml 
 Stock Concentration: 100 mg/ml 
 Final Concentration: 1.3 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acepromazine</td>
 <td>Butler</td>
 <td>003845</td>
 <td>0.5-4 mg/ml 
 Stock Concentration: 10 mg/ml 
 Final Concentration: 0.25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Betadine</td>
 <td>Healthpets</td>
 <td>BET16OZ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ringers</td>
 <td>Abbott</td>
 <td>04860-04-10</td>
 <td>2-3 ml/inj</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Banamine</td>
 <td>Schering-Plough</td>
 <td>0061-0851-03</td>
 <td>2.5 -5 mg/kg 
 Stock Concentration: 50 mg/ml 
 Final Concentration: 0.5 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin</td>
 <td>Sandoz</td>
 <td>0781-3404-85</td>
 <td>80-100 mg/kg 
 Final Concentration: 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LH-RH</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L4513</td>
 <td>200 &mu;g/kg 
 Final Concentration: 200 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14175-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200056 </td>
 <td>Stock Concentration: 0.25 % 
 Final Concentration: 0.125 %</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995073 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>16000044 </td>
 <td>Stock Concentration: 100 % 
 Final Concentration: 10 %</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal Medium</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21103049 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>17504044</td>
 <td>Stock Concentration: 100x 
 Final Concentration: 1x</td>
 </tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Note, use human reagents for grafts of human NSCs</td>
 </tbody>
</table>

promotion of survival and differentiation of neural stem cells with fibrin and growth factor cocktails after severe spinal cord injury

Neurale stamcellen (NSC) kan zichzelf vernieuwen en differentiëren tot neuronen en gliacellen. Getransplanteerd NSCs kan verloren neuronen en gliacellen na dwarslaesie (SCI) te vervangen, en kan functionele relais vormen opnieuw verbinding ruggenmergsegmenten boven en onder een laesie. Eerdere studies enten neurale stamcellen zijn beperkt door onvolledige transplantaatoverleving in het ruggenmerg laesie holte. Verder volgen van transplantaat celoverleving, differentiatie en werkwijze verlenging was niet geoptimaliseerd. Tot slot, in eerdere studies, gekweekte NSCs rat werden meestal gemeld om te differentiëren in glia wanneer geënt op de benadeelde ruggenmerg, in plaats van neuronen, tenzij het lot werd gedreven naar een specifiek celtype. Om deze problemen aan te pakken, hebben we nieuwe methoden ontwikkeld om de overleving, integratie en differentiatie van NSC naar sites van zelfs ernstige SCI verbeteren. NSCs werden vers geïsoleerd uit embryonale dag 14 ruggenmerg (E14) van een stabiele transgene Fischer 344 ratten tot expressie groene fluorescentie eiwit (GFP) en werden ingebed in een fibrine matrix met groeifactoren; deze formulering bedoeld om geënte cellen behouden de laesie holte en ondersteunen celoverleving. NSCs in de fibrine / groeifactor cocktail werden geïmplanteerd twee weken na thoracale niveau 3 (T3) volledige ruggenmerg doorsnijdingen, waardoor piekperiodes van ontsteking vermijden. Resulterende transplantaten volledig gevuld de laesie holte en gedifferentieerd in zowel neuronen, die axonen in de gastheer ruggenmerg dan opmerkelijk lange afstanden, en glia verlengd. Enten van gekweekte menselijke NSCs die GFP geleid tot gelijkaardige bevindingen. Aldus zijn werkwijzen vastgesteld voor het verbeteren neurale stamcel transplantatie, overleving en analyse van in vivo resultaten.

GFP immunohistochemisch etikettering blijkt dat NSC geënte rat opnieuw gesuspendeerd in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (bij gebrek aan een fibrine matrix en groeifactoren) overleefden slecht in de T3 doorsnijding plaats, alleen verbonden aan de laesie / gastheer marge en terwijl de meeste van de laesie leeg zonder geënte cellen (Figuur 2A). De overleving van NSCs verbeterd wanneer samen geënt met fibrine matrices alleen maar het transplantaat niet volledig vullen grote laesie holte (gegev...

Watch this Scientific Journal Video about Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury at JoVE.com

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Fibrine matrices bevattende groeifactoren zijn gebruikt om geënte neurale stamcellen behouden in locaties volledig ruggenmerg doorsnijding. Geënte cellen volledig gevuld de laesie holte en gedifferentieerd in meerdere neurale celtypes, waaronder neuronen die axons verlengd gastheer ruggenmerg over lange afstanden.

Bevordering van Survival en differentiatie van neurale stamcellen met fibrine en groeifactor Cocktails na Ernstige Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Groei en differentiatie van volwassen hippocampus Arctic grondeekhoorn neurale stamcellen

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Chirurgische Transplantatie van Mouse neurale stamcellen in het ruggenmerg van muizen geïnfecteerd met neurotrope Mouse Hepatitis Virus

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Laterale Fluid Percussie: Model van traumatisch hersenletsel bij muizen

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Compleet ruggenmergletsel en Brain Dissection Protocol voor Latere Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in Larvale Overzeese Lamprei

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Identificeren van celoppervlak markeringen van primaire neurale stam en voorlopercellen door metabole labeling van Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...