Name: viability assays for cells in culture
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Viability Assays for Cells in Culture at JoVE.com

نحن نعترف جوليان Jaumotte لفكرة الادخار على كميات الكواشف في مقايسة ATP. نحن ممتنون للغاية للدعم الإداري رائعة مريم كاروسو، ديب ويلسون، وجاكي وفيرر إلى مدرسة MYLAN الصيدلة لتوفير الدعم المالي لهذه الدراسات. وذلك بفضل هي نتيجة لأمراض Hunkele مخيف مؤسسة وباركنسون واضطرابات الحركة مؤسسة على دعمها المالي من الدراسات العصبية الأولية أيضا.

ويتضح التخطيطي للبروتوكولات في الشكل 1. 1. خلية تصفيح خلايا لوحة في لوحات 96 بشكل جيد في مختلف الكثافات الطلاء (الشكل 2). لالشيكات الخطية على خط الخلية العصبية N2A، لوحة 2.5K، 5K، 10K، ...

لقد وجدنا أن قوة الإشارة في جميع المقايسات بقاء ثلاثة هي الخطية والمترابطة مع كثافة الطلاء. ومع ذلك، ليس كل المقايسات حساسة بالتساوي على 2 أضعاف أو تغييرات 1.5 أضعاف في كثافة الطلاء. لخلايا N2A، والأشعة تحت الحمراء هي فحوصات أقل حساسية من فحص ATP، ولا سيما في أقل كثافة الط?...

فحص الجدوى الأكثر شيوعا في العلوم البيولوجية ينطوي على عدد الخلايا. ويتجلى ذلك من خلال إجراء تحليل للأعلى (أحدث) 200 المطبوعات التي ظهرت في مجلات مع أي من الكلمات الرئيسية &quot;في المختبر&quot; أو &quot;ثقافة&quot; على 2013/04/29 2013/04/30 و. من هذه المنشورات، 23.5٪ تستخدم فحوصات تعداد خلايا، بما في ذلك دليل التهم عدد الخلايا، عدد الخلايا الآلي التهم مع برامج التصوير، والتريبان الأزرق الاستبعاد. تم استخدام لايف / الميت في مقايسة 1٪ من هذه المنشورات. وكان الفحص للبقاء الأيض بنسبة 11٪ - عدد المنشورات باستخدام MTT ((4،5-dimethylthiazol-2-YL) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium 3). ويبين هذا المسح من الأدب أيضا أن عدد المنشورات باستخدام فحوصات مثل الإنتقالي العسكري بالتزامن مع المقايسات عدد خلايا كان 3.5٪ فقط. على الرغم من الاتجاه لاستخدام واحد مقايسة جدوى في حد ذاته، وتقييم وظيفة الخلوية بالاشتراك مع عدد الخلايا يبدو الخيار الأفضل لتقييم ط الخلويةntegrity. عدد الخلايا في حد ذاتها ليست كافية لأن الخلايا المتبقية قد لا تكون وظيفية أو صحية على الرغم من أنها موجودة في البئر 1،2. على العكس، وتدابير وظيفية مثل ATP قد تزيد أو تنقص في غياب تغييرات موازية في عدد الخلايا. فك ربط قراءات الأيضية من عدد الخلايا يوحي بأن ATP والمقايسات MTT لا ينبغي أبدا أن تستخدم جدوى الفحص الوحيد. في هذا التقرير، وصفت ثلاثة فحوصات قابلية أن مسح كل الهياكل الخلوية وظيفة التمثيل الغذائي، للحصول على عرض أكثر شمولا من النزاهة الخلوية من أي فحص واحد في حد ذاته يمكن تحمله. اثنين من المقايسات لدينا تتطلب تصوير بالأشعة تحت الحمراء الذي يقيس مضان في القنوات نانومتر 700 و 800. ضوضاء منخفضة في موجات الأشعة تحت الحمراء، مما يؤدي إلى ارتفاع إشارة إلى الضوضاء نسب 3. وتصوير أوديسي التي نستخدمها لديها مجموعة ديناميكية 4.5 سجل وبت عمق 16، translatinز 16 إلى 2 أو 65،536 ظلال من الأشعة تحت الحمراء. وهذا يمكن أن يتناقض التصوير اللون 8 بت، والتي توفر سوى 2 8 أو 256 ظلال من اللون لكل طول موجي. وبالتالي، والتصوير 16 بت لديه قرار الدقيقة. تجدر الإشارة إلى أن الصور بالأشعة تحت الحمراء الأصلي وغالبا ما pseudocolored الأخضر (800 نانومتر) والحمراء (700 نانومتر) في التقارير المنشورة للعرض. وتستخدم عادة أوديسي التصوير على حد سواء لالنشاف الغربية والغرب في خلية 4-7. في خلية الغرب على الخلايا الثابتة الفورمالديهايد استخدام الأجسام المضادة الأولية ضد أي بروتين من الفائدة وتسمية لهم بدوره مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية الأشعة تحت الحمراء. وتعرف هذه التقنية لتكون مفيدة بشكل خاص بالنسبة لنهايات الفسفرة 6. لدينا في الغرب في خلية، ونحن وصمة عار الخلايا ثابتة لهيكل الخلية البروتينات α-تويولين أنيبيب العصبية أو البروتين 2 (MAP2) المرتبطة في القناة 800 نانومتر. هذه البروتينات وفيرة بما فيه الكفاية لتحقق نسب عالية إشارة إلى الضوضاء. نحن أيضا لدينا لوحات وصمة عار في 700قناة نانومتر للنوى مع وصمة عار DRAQ5 والسيتوبلازم مع وصمة عار الياقوت. كل من البروتينات هيكل الخلية وDRAQ5 + البقع الياقوت بالتالي تعكس الهياكل الخلوية. فحص صلاحية الثالث يقيس وظيفة التمثيل الغذائي ويسمى &quot;خلية عيار جلو&quot; في هذا الاختبار القائم على luciferase المراسل، والقيم التلألؤ في نسبة مباشرة إلى مستويات ATP. وتستخدم المقايسات ATP شيوعا لقياس خلايا قابلة للحياة 8-12. ومع ذلك، بما في ذلك كلمة &quot;عيار&quot; في اسم الاختبار هو نوعا من تسمية خاطئة لأن الناتج ATP لكل خلية يمكن أن تتغير بوصفها وظيفة من العلاجات السموم وبالتالي فهي ليست دائما في نسبة إلى الخلية رقم 8. كما يمكن أن تتأثر مستويات ATP عن طريق ايقاعات كل يوم 13 وقبل انقسام الخلية 14 و 15 تمايز الخلايا. ومع ذلك، فإن فحص ATP المبين هنا هو بسيطة لأداء ومفيدة لاعبي التنس المحترفين هو مقياس قوية من التمثيل الغذائي16-21 الجدوى، إن لم يكن الخلية رقم في حد ذاته. عن طريق هذا الاختبار لاستكمال الأشعة تحت الحمراء في سيل وبالتالي ينتج الغرب صورة أكثر شمولا من النزاهة الخلوية من أي فحص واحد فقط.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Cell Titer Glo</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:93px;">G7572</td>
			<td style="width:507px;">Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 &#176;C for at least 21 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">18% Formalin</td>
			<td style="width:112px;">Thermo-Shandon</td>
			<td style="width:93px;">9990244</td>
			<td style="width:507px;">Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sucrose</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">S0389</td>
			<td style="width:507px;">It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Odyssey Block</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">927-40003</td>
			<td style="width:507px;">This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 &#176;C for long term use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">21568</td>
			<td style="width:507px;">We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:93px;">S468</td>
			<td style="width:507px;">One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:93px;">S373</td>
			<td style="width:507px;">See above</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Azide (250x)</td>
			<td style="width:112px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:93px;">7144.8-16</td>
			<td style="width:507px;">Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 &#176;C until they become contaminated with debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Mouse anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">T5168</td>
			<td style="width:507px;">This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Mouse anti-MAP2</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">M9942</td>
			<td style="width:507px;">This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">800 nm Goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">926-32210</td>
			<td style="width:507px;">Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">DRAQ5</td>
			<td style="width:112px;">Biostatus</td>
			<td style="width:93px;">DR50200</td>
			<td style="width:507px;">This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sapphire</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">928-40022</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Luminometer</td>
			<td style="width:129px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:189px;">VICTOR3 1420 multilabel counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Odyssey Imager</td>
			<td style="width:129px;">LI-COR</td>
			<td style="width:189px;">9201-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Shaker/Mixer</td>
			<td style="width:129px;">Research Products International</td>
			<td style="width:189px;">248555</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viability assays for cells in culture

عدد الخلايا دليل على المجهر هي وسيلة لتقييم الجدوى الحساسة الخلوية ولكنها تستغرق وقتا طويلا، وبالتالي باهظة الثمن. المقايسات الجدوى محوسبة مكلفة من حيث المعدات ولكن يمكن أن يكون أسرع وأكثر موضوعية من عدد الخلايا اليدوي. ويصف هذا التقرير استخدام ثلاثة من هذه المقايسات جدوى. اثنين من هذه المقايسات والأشعة تحت الحمراء واحد هو الانارة. سواء المقايسات الأشعة تحت الحمراء تعتمد على تصوير أوديسي 16 بت. يستخدم فحص الأشعة تحت الحمراء واحدة وصمة عار DRAQ5 للنوى جنبا إلى جنب مع وصمة عار الياقوت لالعصارة الخلوية وتصور في القناة 700 نانومتر. الفحص بالأشعة تحت الحمراء الأخرى، والغربية في خلية، يستخدم الأجسام المضادة ضد البروتينات هيكل الخلية (α-تويولين أنيبيب أو بروتين يرتبط 2) وتصف لهم في القناة 800 نانومتر. فحص صلاحية الثالث هو فحص الانارة تستخدم عادة لاعبي التنس المحترفين، ولكن نحن نستخدم ربع حجم أوصت لانقاذ على التكاليف. هذه القياسات الخطية وكلها ترتبط مع عدد مLLS مطلي، ولكن تختلف في الحساسية. جميع المقايسات ثلاثة الالتفاف المجهر تستغرق وقتا طويلا وأخذ عينات من البئر كله، وبالتالي تقليل هامش الخطأ. أخيرا، كل من المقايسات يمكن بسهولة أن تكتمل في غضون يوم واحد من نهاية التجربة، والسماح أعداد أكبر من التجارب التي يتعين القيام بها ضمن أطر زمنية قصيرة. ومع ذلك، فإنها كلها تعتمد على افتراض أن الأرقام تظل الخلية بما يتناسب مع قوة الإشارة بعد العلاج، وهو افتراض أن في بعض الأحيان لم يتم، وخاصة بالنسبة للاعبي التنس المحترفين الخلوية. وعلاوة على ذلك، إذا كان زيادة أو نقصان الخلايا في الحجم بعد العلاج، وهذا قد يؤثر على قوة الإشارة دون التأثير على عدد الخلايا. نستنتج أن جميع المقايسات الجدوى، بما في ذلك التهم اليدوي، يعاني من عدد من المحاذير، ولكن هذا المقايسات الجدوى محوسبة تستحق الاستثمار الأولي. باستخدام جميع المقايسات الثلاثة معا تعطي رؤية شاملة للبنية الخلية ووظيفتها.

عامل معدل الحد في هذه التجارب هو تلطيخ الأشعة تحت الحمراء، وفحص ATP هو وجيزة نسبيا من حيث المدة. لفحوصات بالأشعة تحت الحمراء، ونحن نتوقع أن ثماني لوحات 96 بشكل جيد يمكن أن تكون ملطخة ومسحها ضوئيا في غضون يوم واحد بواسطة مذهلة دفعتين من أربع لوحات لكل منها (انظر الشكل...

Watch this Scientific Journal Video about Viability Assays for Cells in Culture at JoVE.com

Viability Assays for Cells in Culture

وغالبا ما يتم فحص المركبات العلاجية الأولى في المختبر مع المقايسات جدوى. عدد الخلايا أعمى من قبل المراقب الإنسان يمكن أن تكون حساسة للغاية للتغيرات صغيرة في عدد الخلايا ولكن لا تقييم وظيفة. المقايسات الجدوى المحوسبة، كما هو موضح هنا، يمكن تقييم كل من هيكل وظيفة بطريقة موضوعية.

فحوصات قابلية للخلايا في الثقافة

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

العد وتحديد صلاحية خلايا مثقف

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

فحوصات Neurocircuit عن المضبوطات في المسوخ من الصرع ذبابة الفاكهة</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

فحوصات مراسل المتوازية نطاق واسع في خلايا الثدييات مثقف

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

فحوصات لتدهور تتجمع البروتينات في الخلايا

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...