Name: viability assays for cells in culture
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Viability Assays for Cells in Culture at JoVE.com

Vi erkjenner Juliann Jaumotte for ideen om å spare på volumene av reagenser i ATP-analysen. Vi er dypt takknemlige for den flotte administrativ støtte av Maria Caruso, Deb Willson, og Jackie Farrer og til Mylan School of Pharmacy for å gi økonomisk støtte til disse studiene. En takk også til de Hunkele fryktede sykdommer Foundation og Parkinsons og bevegelsesforstyrrelser Foundation for sin økonomiske støtte til de primære nevrale studier.

Et skjema av protokollene er illustrert i figur 1.. En. Cell Plating Plate-celler i 96-brønners plater ved forskjellige pletteringstettheter (figur 2). For linearitetskontroll på N2a neuroblastom cellelinje, plate 2.5k, 5k, 10k og 15k celler per brønn i tre eller seks brønner / gruppe. For linearitetskontroll hos rotte primære kortikale nevroner, plate 25k, 50k, 100k og 200k celler per brønn i tre eller seks brønner / gruppe...

Vi har funnet at signalstyrken i alle tre levedyktighet assays er lineær og korrelert med pletteringstetthet. Men ikke alle analysene er like følsom for to-ganger eller 1,5 ganger endringer i pletteringstetthet. For N2A-celler, de infrarøde analyser er mindre følsom enn den ATP-analysen, spesielt ved lavere densiteter plating. Selv om de infrarøde analyser er mindre følsom enn ATP, den DRAQ5 + Sapphire assays og α-tubulin assays er i god overensstemmelse ved at de avslører meget beskyttende virkning av N-acetyl-...

Den vanligste levedyktighet analysen i de biologiske vitenskaper innebærer celletall. Dette er dokumentert av en analyse av de beste (de siste) 200 publikasjoner som dukket opp i PubMed med noen av søkeordene &quot;in vitro&quot; eller &quot;kultur&quot; på 4/29/2013 og 4/30/2013. Av disse publikasjonene, 23,5% brukte celle count analyser, inkludert manuelle mobilnummer teller, teller automatiserte celle nummer med bildebehandlingsprogrammer, og Trypanblå eksklusjon. Live / Døde analysen ble brukt i 1% av disse publikasjonene. Den rekke publikasjoner ved hjelp av MTT (3 - (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) assay for metabolsk levedyktighet var 11%. Denne undersøkelse av litteraturen viser også at antallet publikasjoner bruke assays slik som MTT i forbindelse med celletall assays var bare 3,5%. Til tross for trenden å bruke en levedyktighet analysen av seg selv, vurdere cellular funksjon i kombinasjon med cellenummer synes det beste valget for å vurdere cellular jegntegrity. Celletellinger av seg selv er ikke tilstrekkelig, fordi de gjenværende celler ikke kan være funksjonelle eller friske selv om de er til stede i brønnen 1,2. Motsatt kan funksjonelle tiltak som ATP øke eller redusere i fravær av parallelle endringer i antall celler. Den frakopling av metabolske avlesninger fra celle nummer antyder at ATP og MTT-assay aldri skal brukes som eneste levedyktighet assay. I den foreliggende rapporten, er tre levedyktighet analyser som kartlegger både mobil strukturer og metabolsk funksjon beskrevet, for en mer omfattende oversikt over mobilnettet integritet enn noen én analyse av seg selv kan ha råd til. To av våre analyser krever en infrarød imager som måler fluorescens i de 700 og 800 nm kanaler. Støy er lav i de infrarøde bølgelengder, noe som fører til høyere signal-til-støy-forhold tre. The Odyssey imager som vi bruker har en 4,5 log dynamisk område og en bit-dybde på 16, translating til to 16 eller 65 536 nyanser av infrarød. Dette kan stå i motsetning til 8-bits fargebilder, noe som bare gir 2 8 eller 256 nyanser av farge for hver bølgelengde. Således har 16-bit bilde finere oppløsning. Det bør bemerkes at de originale infrarøde bilder er ofte pseudocolored grønn (800 nm) og rødt (700 nm) i publiserte rapporter for presentasjon. Odyssey kameraer blir ofte brukt både for Western blotting og I-Cell Westerns 4-7. I-Cell Westerns på formaldehyd faste celler bruker primære antistoffer mot ethvert protein av interesse og merke dem i sving med infrarøde fluorescerende sekundære antistoffer. Denne teknikken er kjent for å være spesielt nyttig for fosforylering endepunkter seks. I vår I-Cell Westerns, beis vi faste celler for cytoskeletal proteiner α-tubulin eller nevronale microtubule assosiert protein 2 (MAP2) i 800 nm kanal. Disse proteinene er rikelig nok til å gi høye signal-til-støy-forhold. Vi har også beis våre plater i 700nm kanal for atomkjerner med DRAQ5 flekken og for cytoplasma med Sapphire flekken. Både cytoskeletal proteiner og DRAQ5 + Sapphire flekker dermed reflektere cellulære strukturer. Den tredje analysen måler levedyktighet metabolsk funksjon, og kalles &quot;Cell Titer Glo.&quot; I denne luciferase-baserte assay, luminescens verdier er i direkte forhold til ATP-nivåer. ATP-analyser blir ofte brukt til å kvantifisere levedyktige celler 8-12. Imidlertid inneholder ordet &quot;titer&quot; i navnet til analysen er misvisende, fordi ATP produksjon per celle kan endres som en funksjon av toksin-behandlinger, og er derfor ikke alltid i forhold til celletallet 8.. ATP-nivåer kan også bli påvirket av døgnrytme 13 og ved celledeling 14 og celledifferensiering 15. Ikke desto mindre ATP-analysen er vist her er enkel å utføre og nyttig fordi ATP er en robust mål for metabolsklevedyktighet 16-21, hvis ikke celle nummer per se. Ved hjelp av denne analysen for å utfylle den infrarøde I-Cell Westerns gir derfor et mer helhetlig bilde av cellulær integritet enn noen én analyse alene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Cell Titer Glo</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:93px;">G7572</td>
			<td style="width:507px;">Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 &#176;C for at least 21 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">18% Formalin</td>
			<td style="width:112px;">Thermo-Shandon</td>
			<td style="width:93px;">9990244</td>
			<td style="width:507px;">Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sucrose</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">S0389</td>
			<td style="width:507px;">It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Odyssey Block</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">927-40003</td>
			<td style="width:507px;">This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 &#176;C for long term use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">21568</td>
			<td style="width:507px;">We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:93px;">S468</td>
			<td style="width:507px;">One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:93px;">S373</td>
			<td style="width:507px;">See above</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Azide (250x)</td>
			<td style="width:112px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:93px;">7144.8-16</td>
			<td style="width:507px;">Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 &#176;C until they become contaminated with debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Mouse anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">T5168</td>
			<td style="width:507px;">This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Mouse anti-MAP2</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">M9942</td>
			<td style="width:507px;">This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">800 nm Goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">926-32210</td>
			<td style="width:507px;">Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">DRAQ5</td>
			<td style="width:112px;">Biostatus</td>
			<td style="width:93px;">DR50200</td>
			<td style="width:507px;">This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sapphire</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">928-40022</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Luminometer</td>
			<td style="width:129px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:189px;">VICTOR3 1420 multilabel counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Odyssey Imager</td>
			<td style="width:129px;">LI-COR</td>
			<td style="width:189px;">9201-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Shaker/Mixer</td>
			<td style="width:129px;">Research Products International</td>
			<td style="width:189px;">248555</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viability assays for cells in culture

Manuelle celletall på et mikroskop er en følsom måte å vurdere cellelevedyktigheten, men er tidskrevende og derfor kostbart. Datastyrt levedyktighet analyser er dyrt i form av utstyr, men kan være raskere og mer objektiv enn manuelle celletall. Den foreliggende rapport beskriver bruken av tre slike levedyktighet assays. To av disse analysene er infrarødt og en er selvlysende. Begge infrarøde analyser stole på en 16 bit Odyssey Imager. En infrarød analysen bruker DRAQ5 flekken for kjerner kombinert med Sapphire flekken for cytosol og er visualisert i 700 nm kanal. Den andre infrarøde analysen, en I-Cell Western, bruker antistoffer mot cytoskeletal proteiner (α-tubulin eller mikrotubulus assosiert protein 2) og skiltene dem i 800 nm kanal. Den tredje levedyktighet analysen er en vanlig selvlysende analysen for ATP, men vi bruker en fjerdedel av det anbefalte volumet for å spare på kostnadene. Disse målingene er alle lineære og korrelerer med antallet cells belagt, men varierer i sensitivitet. Alle tre assays omgå tidkrevende mikroskopi og prøve den hele brønnen, og dermed redusere utvalgsfeil. Endelig alle assays kan lett fullføres i løpet av en dag ved slutten av eksperimentet, slik at et større antall forsøk som skal utføres i løpet av korte tidsrammer. Men alle er avhengige av antagelsen om at celletall forbli i forhold til signalstyrken etter behandlinger, en antagelse som noen ganger ikke er oppfylt, spesielt for mobilnettet ATP. Videre, hvis celler øke eller avta i størrelse etter behandling, kan dette påvirker signalstyrken uten å påvirke cellenummer. Vi konkluderer med at alle levedyktighet analyser, inkludert manuelle tellinger, lider av en rekke advarsler, men at datastyrte levedyktighet analysene er vel verdt den opprinnelige investeringen. Bruke alle tre analysene gir sammen et helhetlig syn på cellestruktur og funksjon.

Den hastighetsbegrensende faktor i disse eksperimenter er det infrarøde flekker, som ATP-analysen er relativt korte i varighet. For de infrarøde analyser, forventer vi at åtte 96-brønners plater kan være farget og skannet i løpet av én dag etter svimlende to grupper av fire plater hver (se figur 1). Denne beregningen forutsetter 20 min for fiksering, 30 min for vasking, 30 min for å blokkere, 2 timers primært antistoff, etterfulgt av inkubering i 30 min med vaskinger 1 time sekundært antistoff...

Watch this Scientific Journal Video about Viability Assays for Cells in Culture at JoVE.com

Viability Assays for Cells in Culture

Terapeutiske forbindelser blir ofte først undersøkt in vitro med levedyktighet assays. Blindcelletellingene med en menneskelig observatør kan være meget følsom for små endringer i cellenummer, men ikke vurdere funksjon. Datastyrt levedyktighet analyser, slik det er beskrevet her, kan vurdere både struktur og funksjon på en objektiv måte.

Levedyktighet Analyser for celler i kultur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Vurdering av Mitokondrielle funksjoner og celleviabilitet i nyre celler ved overuttrykk Protein C isozymer

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Sammen Analyser for Monitoring Protein Refolding i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Massivt Parallelle Reporter Analyser i dyrkede pattedyrceller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Assays for nedbrytning av misfoldede Proteiner i Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...