Name: viability assays for cells in culture
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Viability Assays for Cells in Culture at JoVE.com

Reconocemos Juliann Jaumotte a la idea de ahorrar en los volúmenes de reactivos en el ensayo de ATP. Estamos profundamente agradecidos por el apoyo administrativo extraordinario de María Caruso, Deb Willson, y Jackie Farrer y para la Escuela de Farmacia de Mylan para proporcionar apoyo financiero para estos estudios. Gracias también a las Enfermedades Hunkele Temido Fundación y el Parkinson y Trastornos del Movimiento de la Fundación por su apoyo financiero de los estudios primarios de neuronas.

Un diagrama esquemático de los protocolos se ilustra en la Figura 1. 1. Celular Plating Células de la placa en placas de 96 pocillos a diferentes densidades de chapado (Figura 2). Para comprobaciones de linealidad en la línea celular de neuroblastoma N2a, placa 2.5k, 5k, 10k, 15k y células por pocillo en 3 o 6 pocillos / grupo. Para comprobaciones de linealidad en las neuronas corticales primarias de rata, placa de 25k, 50k, 10...

Hemos encontrado que la intensidad de la señal en los tres ensayos de viabilidad es lineal y se correlacionó con densidad de placas. Sin embargo, no todos los ensayos son igualmente sensibles a 2 veces o cambios 1.5 veces en la densidad de placas. Para las células N2a, los ensayos de infrarrojos son menos sensibles que el ensayo de ATP, particularmente a densidades más bajas de chapado. Aunque los ensayos de infrarrojos son menos sensibles que los ATP, los ensayos DRAQ5 + Zafiro y los ensayos de α-tubulina están e...

El ensayo de viabilidad más común en las ciencias biológicas implica el recuento de células. Esto se evidencia por un análisis de los mejores (los más recientes) 200 publicaciones que aparecieron en PubMed con cualquiera de las palabras clave &quot;in vitro&quot; o &quot;cultura&quot; en 29/04/2013 y 30/04/2013. De estas publicaciones, el 23,5% utilizan ensayos de recuento de células, incluyendo recuento de número de células manuales, el número de células automatizado cuenta con software de imágenes, y Trypan exclusión de azul. El ensayo Live / Dead se utilizó en el 1% de estas publicaciones. El número de publicaciones utilizando el MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) de ensayo para la viabilidad metabólica era 11%. Esta revisión de la literatura también muestra que el número de publicaciones que utilizan ensayos tales como MTT junto con ensayos de recuento de células fue sólo del 3,5%. A pesar de la tendencia a usar un ensayo de viabilidad por sí mismo, la evaluación de la función celular en combinación con el número de células parece ser la mejor elección para la evaluación de i celularntegridad. Los recuentos de células por sí mismas no son suficientes debido a que las células restantes pueden no ser funcional o sano a pesar de que están presentes en el pocillo 1,2. A la inversa, las medidas funcionales tales como ATP pueden aumentar o disminuir en ausencia de cambios paralelos en el número de células. El desacoplamiento de las lecturas metabólicas del número de células sugiere que los ensayos de la ATP y MTT nunca debe ser usado como el único ensayo de viabilidad. En el presente informe, tres ensayos de viabilidad control que analicen tanto las estructuras celulares y la función metabólica se describen, por una visión más completa de la integridad celular que cualquier ensayo por sí solo puede permitirse. Dos de nuestros ensayos requieren una cámara infrarroja que mide la fluorescencia en los 700 y 800 nm canales. El ruido es baja en las longitudes de onda infrarrojas, lo que lleva al aumento de la relación señal-ruido 3. El generador de imágenes Odyssey que usamos tiene un rango dinámico 4,5 log y una profundidad de bits de 16, Translatinga 2 16 o 65.536 tonos de infrarrojos. Esto se puede contrastar con imágenes en color de 8 bits, que sólo ofrece 2 8 o 256 tonos de color para cada longitud de onda. Por lo tanto, de formación de imágenes de 16 bits tiene una resolución más fina. Cabe señalar que las imágenes infrarrojas originales son a menudo pseudocoloreada verde (800 nm) y roja (700 nm) en los informes publicados para la presentación. Cámaras Odyssey son de uso común tanto para Western Blot e In-Cell Westerns 4-7. Dentro de la célula del Oeste en las células fijadas con formaldehído utilizan anticuerpos primarios contra cualquier proteína de interés y etiquetarlos a su vez con anticuerpos secundarios fluorescentes infrarrojos. Esta técnica es conocida por ser particularmente útil para los puntos finales de fosforilación 6. En nuestra en la celda del Oeste, que tiñe las células fijadas para las proteínas del citoesqueleto α-tubulina o microtúbulos neuronales proteína asociada 2 (MAP2) en el canal de 800 nm. Estas proteínas son lo suficientemente abundantes para producir alta relación señal-ruido. También tiñe nuestros platos en el 700canal nm para núcleos con la mancha de DRAQ5 y para el citoplasma con la mancha de zafiro. Tanto las proteínas del citoesqueleto y las DRAQ5 + manchas Sapphire por lo tanto reflejan las estructuras celulares. El tercer ensayo de viabilidad mide la función metabólica y se llama &quot;célula Titulación Glo.&quot; En este ensayo basado en la luciferasa, los valores de luminiscencia están en proporción directa a los niveles de ATP. Ensayos de ATP se utilizan comúnmente para cuantificar las células viables 8-12. Sin embargo, incluyendo la palabra &quot;título&quot; en el nombre del ensayo es algo de un nombre inapropiado porque la producción de ATP por célula puede cambiar como una función de los tratamientos de toxina y es, por tanto, no siempre en proporción al número de células 8. Los niveles de ATP también pueden verse afectados por los ritmos circadianos 13 y por la división celular y la diferenciación celular 14 15. Sin embargo, el ensayo de ATP se muestra aquí es simple de realizar y útil porque ATP es una medida robusta de metabólicaviabilidad 16-21, si no del teléfono celular número en sí. Utilizando este ensayo para complementar el infrarrojo en la celda del Oeste, por lo tanto se obtiene un panorama más completo de la integridad celular de un ensayo de cualquier solo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Cell Titer Glo</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:93px;">G7572</td>
			<td style="width:507px;">Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 &#176;C for at least 21 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">18% Formalin</td>
			<td style="width:112px;">Thermo-Shandon</td>
			<td style="width:93px;">9990244</td>
			<td style="width:507px;">Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sucrose</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">S0389</td>
			<td style="width:507px;">It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Odyssey Block</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">927-40003</td>
			<td style="width:507px;">This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 &#176;C for long term use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">21568</td>
			<td style="width:507px;">We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:93px;">S468</td>
			<td style="width:507px;">One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:93px;">S373</td>
			<td style="width:507px;">See above</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Azide (250x)</td>
			<td style="width:112px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:93px;">7144.8-16</td>
			<td style="width:507px;">Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 &#176;C until they become contaminated with debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Mouse anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">T5168</td>
			<td style="width:507px;">This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Mouse anti-MAP2</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">M9942</td>
			<td style="width:507px;">This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">800 nm Goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">926-32210</td>
			<td style="width:507px;">Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">DRAQ5</td>
			<td style="width:112px;">Biostatus</td>
			<td style="width:93px;">DR50200</td>
			<td style="width:507px;">This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sapphire</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">928-40022</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Luminometer</td>
			<td style="width:129px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:189px;">VICTOR3 1420 multilabel counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Odyssey Imager</td>
			<td style="width:129px;">LI-COR</td>
			<td style="width:189px;">9201-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Shaker/Mixer</td>
			<td style="width:129px;">Research Products International</td>
			<td style="width:189px;">248555</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viability assays for cells in culture

Manual de células en un microscopio son un medio sensible de la evaluación de la viabilidad celular, pero consumen mucho tiempo y por lo tanto caro. Ensayos de viabilidad computarizados son costosos en términos de equipo, pero puede ser más rápido y más objetivo que el recuento de células manuales. El presente informe se describe el uso de tres de estos ensayos de viabilidad. Dos de estos ensayos son de infrarrojos y uno es luminiscente. Ambos ensayos infrarrojos se basan en un Imager 16 bits Odyssey. Un ensayo de infrarrojos utiliza la mancha de DRAQ5 para los núcleos combinados con la mancha de zafiro de citosol y se visualiza en el canal de 700 nm. El otro ensayo de infrarrojos, una en la celda Occidental, utiliza anticuerpos contra las proteínas del citoesqueleto (proteína asociada α-tubulina o microtúbulos 2) y los etiqueta en el canal 800 nm. El tercer ensayo de viabilidad es un ensayo luminiscente comúnmente utilizado para el ATP, pero usamos un cuarto del volumen recomendado para ahorrar en coste. Estas mediciones son lineales y se correlacionan con el número de CElls plateado, pero varían en sensibilidad. Todos los tres ensayos de eludir microscopía de tiempo y muestrean todo el pozo, reduciendo así el error de muestreo. Por último, todos los ensayos fácilmente se puede completar en un día del final del experimento, lo que permite un mayor número de experimentos a realizar en plazos cortos. Sin embargo, todos ellos se basan en el supuesto de que el número de células permanecen en proporción a la intensidad de la señal después de los tratamientos, la suposición de que a veces no se cumple, especialmente para ATP celular. Además, si las células aumentan o disminuyen de tamaño después del tratamiento, esto podría afectar la fuerza de la señal sin afectar el número de células. Llegamos a la conclusión de que todos los ensayos de viabilidad, incluidos los recuentos manuales, adolecen de una serie de advertencias, pero que los ensayos de viabilidad computarizados son bien vale la pena la inversión inicial. El uso de los tres ensayos en conjunto da una visión completa de la estructura y la función celular.

El factor limitante de la velocidad en estos experimentos es la tinción de infrarrojos, como el ensayo de ATP es relativamente de breve duración. Para los ensayos de infrarrojos, anticipamos que ocho placas de 96 pocillos se pueden teñir y escanean el plazo de un día a la asombrosa cifra de dos lotes de cuatro platos cada una (ver Figura 1). Esta estimación asume 20 min de la fijación, de 30 minutos de lavado, 30 min de bloqueo, 2 horas de incubación del anticuerpo primario seguido de 30 min de l...

Watch this Scientific Journal Video about Viability Assays for Cells in Culture at JoVE.com

Viability Assays for Cells in Culture

Los compuestos terapéuticos a menudo se examinaron por primera vez in vitro con los ensayos de viabilidad. Recuentos de células ciegos por un observador humano puede ser muy sensible a pequeños cambios en el número de células, pero no evaluar la función. Ensayos de viabilidad computarizados, tal como se describe aquí, pueden evaluar tanto la estructura y función de una manera objetiva.

Los ensayos de viabilidad de las células en cultivo

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Contar y determinar la viabilidad de las células cultivadas

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Investigación

Biología

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit ensayos para las convulsiones en la epilepsia de los mutantes Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

El análisis de Schwann-astrocito interacciones utilizando In Vitro Ensayos

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Los ensayos para la degradación de proteínas en células de mal plegadas

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...