Name: viability assays for cells in culture
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Viability Assays for Cells in Culture at JoVE.com

Vi erkänner Juliann Jaumotte för idén om att spara på de volymer av reagens i ATP-analysen. Vi är djupt tacksamma för den fantastiska administrativt stöd av Mary Caruso, Deb Willson, och Jackie Farrer och till Mylan School of Pharmacy för att ge ekonomiskt stöd till dessa studier. Tack också till Hunkele fruktade sjukdomar Foundation och Parkinsons och rörelserubbningar Foundation för deras ekonomiska stöd av de primära neuronala studierna.

Ett schema över de protokoll som illustreras i figur 1. 1. Cell Plating Plate celler i 96-brunnsplattor vid olika pläterings densiteter (figur 2). För linjäritet kontroller av N2a neuroblastomcellinje, tallrik 2.5k, 5k, 10k och 15k celler per brunn i 3 eller 6 brunnar / grupp. För linjäritet kontroller i råtta primära kortikala neuroner, platta 25k, 50k, 100k och 200k celler per brunn i 3 eller 6 brunnar / grupp. Om de cell...

Vi har funnit att signalstyrkan i alla tre viabilitet analyser är linjär och korreleras med plätering densitet. Men inte alla de analyser som är lika känslig för två-faldig eller 1,5-faldiga förändringar av plätering densitet. För N2A-celler, de infraröda analyser är mindre känsliga än ATP-analysen, särskilt vid lägre bordläggningen tätheter. Trots att de infraröda analyser är mindre känsliga än ATP, den DRAQ5 + Sapphire analyser och α-tubulin analyser är i god överensstämmelse i att de avslö...

Den vanligaste viabilitetsanalys i de biologiska vetenskaperna innebär kroppar. Detta framgår av en analys av de bästa (senaste) 200 publikationer som dök upp i PubMed med något av sökorden &quot;in vitro&quot; eller &quot;kultur&quot; på 2013/04/29 och 2013/04/30. Av dessa publikationer, 23,5% används analyser celltals, inklusive manuella cellnummer räknas, automatiserad cellnummer räknar med bildbehandlingsprogram, och trypanblåttuteslutning. Live / Dead analys användes i en% av dessa publikationer. Det antal publikationer med hjälp av MTT-(3 - (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid)-analysen för metabolisk livsduglighet var 11%. Denna genomgång av litteraturen visar också att antalet publikationer med hjälp analyser såsom MTT tillsammans med celltalsanalyser var endast 3,5%. Trots trenden att använda en livskraft analys av sig själv, bedöma cellulär funktion i kombination med cellnummer verkar det bästa valet för att bedöma cellulära integrity. Celltal i sig själva inte är tillräckliga, eftersom de återstående cellerna inte kan vara funktionell eller friska trots att de är närvarande i väl 1,2. Omvänt kan funktionella åtgärder såsom ATP ökar eller minskar i avsaknad av parallella förändringar i antalet celler. Den frikoppling av metabola avläsning från antalet celler tyder på att ATP-och MTT-analyser bör aldrig användas som enda livskraft analysen. I denna rapport är tre lönsamhetsanalyser som kart både cellulära strukturer och metabolisk funktion beskrivs, för en mer heltäckande bild av cellulära integritet än någon analys i sig har råd med. Två av våra analyser kräver en infraröd kameran som mäter fluorescens i de 700 och 800 nm kanaler. Buller är låg i de infraröda våglängder, vilket leder till högre signal-till-brus-förhållanden 3. Odyssey Imager som vi använder har en 4,5 log dynamiskt omfång och lite djup av 16, translating till 2 16 eller 65.536 nyanser av infrarött. Detta kan ställas i kontrast till 8-bitars färgavbildning, vilket bara ger 2 8 eller 256 färgnyanser för varje våglängd. Därmed har 16-bitars bildbehandling bättre upplösning. Det bör noteras att de ursprungliga värmebilder är ofta pseudocolored grön (800 nm) och röda (700 nm) i publicerade rapporter för presentation. Odyssey kameror används ofta både för Western blotting och I-Cell Westerns 4-7. I-cell Westerns på formaldehydfixerade celler använder primära antikroppar mot något protein av intresse och märka dem i tur och ordning med infraröd fluorescerande sekundära antikroppar. Denna teknik är känd för att vara särskilt användbart för fosforylering endpoints 6. I vår I-Cell Westerns, vi färga fixerade celler för cytoskelettproteiner α-tubulin eller neuronala mikrotubuli associerat protein 2 (MAP2) i 800 nm-kanalen. Dessa proteiner är tillräckligt omfattande för att ge en hög signal-till-brus-förhållanden. Vi fläckar också våra tallrikar i 700nm-kanal för kärnor med DRAQ5 fläcken och för cytoplasman med Sapphire fläcken. Både cytoskelettproteiner och DRAQ5 + Sapphire fläckar speglar alltså cellstrukturer. Den tredje analys livskraft mäter metabolisk funktion och kallas &quot;Cell Titer Glo.&quot; I denna luciferas-baserad analys, luminiscens värden är i direkt proportion till ATP-nivåer. ATP-analyser används allmänt för att kvantifiera livskraftiga celler 8-12. Men även ordet &quot;titer&quot; i namn av analysen är något av en missvisande eftersom ATP produktionen per cell kan förändras som en funktion av toxinbehandlingar och är därför inte alltid i proportion till cell nummer 8. ATP-nivåer kan också påverkas av dygnsrytmen 13 och genom celldelning 14 och celldifferentiering 15. Ändå är den ATP-analys visas här enkelt att utföra och användbara eftersom ATP är en robust mått på metabolisklivskraft 16-21, om inte antalet celler i sig. Med hjälp av denna analys för att komplettera den infraröda I-Cell Westerns ger därför en mer heltäckande bild av cellulära integritet än någon analys ensam.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Cell Titer Glo</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:93px;">G7572</td>
			<td style="width:507px;">Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 &#176;C for at least 21 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">18% Formalin</td>
			<td style="width:112px;">Thermo-Shandon</td>
			<td style="width:93px;">9990244</td>
			<td style="width:507px;">Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sucrose</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">S0389</td>
			<td style="width:507px;">It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Odyssey Block</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">927-40003</td>
			<td style="width:507px;">This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 &#176;C for long term use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">21568</td>
			<td style="width:507px;">We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:93px;">S468</td>
			<td style="width:507px;">One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:93px;">S373</td>
			<td style="width:507px;">See above</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Azide (250x)</td>
			<td style="width:112px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:93px;">7144.8-16</td>
			<td style="width:507px;">Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 &#176;C until they become contaminated with debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Mouse anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">T5168</td>
			<td style="width:507px;">This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Mouse anti-MAP2</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">M9942</td>
			<td style="width:507px;">This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">800 nm Goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">926-32210</td>
			<td style="width:507px;">Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">DRAQ5</td>
			<td style="width:112px;">Biostatus</td>
			<td style="width:93px;">DR50200</td>
			<td style="width:507px;">This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sapphire</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">928-40022</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Luminometer</td>
			<td style="width:129px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:189px;">VICTOR3 1420 multilabel counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Odyssey Imager</td>
			<td style="width:129px;">LI-COR</td>
			<td style="width:189px;">9201-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Shaker/Mixer</td>
			<td style="width:129px;">Research Products International</td>
			<td style="width:189px;">248555</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viability assays for cells in culture

Manuella kroppar på ett mikroskop är ett känsligt sätt att bedöma cellulär viabilitet, men är tidskrävande och därför dyra. Datoriselönsamhetsanalyser är dyrt i form av utrustning, men kan vara snabbare och mer objektiv än manuella kroppar. Den här rapporten beskriver användningen av tre sådana lönsamhetsanalyser. Två av dessa analyser är infrarött och en är luminiscerande. Båda IR-analyser är beroende av en 16 bitars Odyssey Imager. En infraröd analys använder DRAQ5 fläcken för kärnor kombinerat med Sapphire fläcken för cytosolen och visualiseras i 700 nm-kanalen. Den andra IR-analysen, en in-Cell Västra använder antikroppar mot cytoskelettproteiner (α-tubulin eller mikrotubuli associerat protein 2) och märker dem i 800 nm-kanalen. Den tredje analys livskraft är en vanligt förekommande självlysande analys för ATP, men vi använder en fjärdedel av den rekommenderade volymen för att spara på kostnader. Dessa mätningar är alla linjära och korrelerar med antalet cells klädd, men varierar i känslighet. Alla tre analyser kringgå tidskrävande mikroskopi och prova hela väl och därmed minska urvalsfel. Slutligen kan alla analyserna lätt vara slutförd inom en dag i slutet av försöket, vilket gör att ett större antal experiment som ska utföras inom korta tidsramar. Men de har alla förlitar sig på antagandet att antalet celler förblir i proportion till signalstyrka efter behandlingar, ett antagande som ibland inte är uppfyllt, i synnerhet för cellulär ATP. Vidare, om celler ökar eller minskar i storlek efter behandling, kan detta påverka signalstyrkan utan att påverka cellantal. Vi drar slutsatsen att alla lönsamhetsanalyser, inklusive manuella räkningar, lider av ett antal förbehåll, men att datoriserade lönsamhetsanalyser är väl värda den ursprungliga investeringen. Använda alla tre analyser tillsammans ger en heltäckande bild av cellstruktur och funktion.

Den hastighetsbegränsande faktorn i dessa experiment är den infraröda färgning, såsom ATP-analysen är relativt kort varaktighet. För IR-analyser, räknar vi med att åtta 96-brunnar kan färgas och skannas inom en dag av svindlande två partier av fyra plattor vardera (se figur 1). Denna bedömning utgår från 20 min för fixering, 30 min av tvätt, 30 min av blockering, 2 tim primär antikropp inkubation följt av 30 min tvättar, 1 tim sekundär antikropp inkubation följt av 30 min tvättar, ...

Watch this Scientific Journal Video about Viability Assays for Cells in Culture at JoVE.com

Viability Assays for Cells in Culture

Terapeutiska föreningar är ofta först undersökas in vitro med lönsamhetsanalyser. Blind celltal av en mänsklig observatör kan vara mycket känsliga för små förändringar i antalet celler men inte bedöma funktion. Datorise viabilitet analyser, som beskrivs här, kan bedöma både struktur och funktion på ett objektivt sätt.

Bärkraft: Analyser för celler i odling

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Räkning och Avgöra genomförbarhet för odlade celler

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Neurocircuit analyser för epileptiska anfall Mutationsformer av Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analys av Schwann-astrocyternas interaktioner Använda In Vitro Analyser

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Bedömning av Mitokondriella funktioner och cellviabilitet i Renal celler som överuttrycker proteinkinas C-isozymer

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Kopplade Analyser för övervakning Proteinåterveckningssteg i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Massively Parallel Reporter Analyser hos odlade däggdjursceller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Analyser för nedbrytningen av Felveckade proteiner i celler

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...