Name: culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface
Uploaded: 2013-10-08T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface at JoVE.com

De auteurs willen graag Lisa Dailey bedanken voor de nuttige ingangen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (ES013611 en HL095163), de Steward Medical Research Institute (FAMRI) en de Environmental Protection Agency (CR83346301) en verklaart geen belangenconflict. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health. Hoewel de in dit artikel beschreven onderzoek is mede gefinancierd door het US Environmental Protection Agency via samenwerkingsovereenkomst CR83346301 met het Center for Environmental Medicine, Astma en Long Biologie aan de Universiteit van North Carolina, Chapel Hill, is het niet onderworpen aan de bureau&#39;s nodig collegiale en beleidsevaluatie en dus niet noodzakelijk overeen met de standpunten van het agentschap, en geen officiële goedkeuring moet worden afgeleid. Vermelden of handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik. Loretta Müller wordt ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation met een persoonlijke subsidie.

1. Bereid Plastic Ware: Jas Plate <ol><li> Voeg 500 ul PureCol (1:100 verdund met steriel water) aan elk putje van een 12-wells plaat. </li><li> Incubeer bij 37 ° C in een incubator gedurende 30 minuten, verwijder de PureCol en spoel af met HBSS vlak voor de cellen worden toegevoegd aan de plaat (zie stap 3.1 hieronder). </li></ol> 2. Verkrijgen en voorbehandeling van biopsie van Human NEC <ol><li> Nasale schrapen biopsie <ol><li> Verkrijgen oppervlakkige EC langs de neusschelpen onder direc...

<ol>
	<li>Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+decision+makers:+in+search+of+the+'epimmunome.">Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome.</a> Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses.">The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).</li><li>Muller, L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cells,+the+"switchboard"+of+respiratory+immune+defense+responses:+Effects+of+air+pollutants.">Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants.</a> Swiss Med. Wkly. , (2012).</li><li>Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+epithelial+cells+in+innate+immunity+to+influenza+virus+infection.">Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection.</a> Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).</li><li>Robertson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemokines+in+the+biology+of+natural+killer+cells.">Role of chemokines in the biology of natural killer cells.</a> J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).</li><li>Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cytokines+on+human+bronchial+epithelial+cells+induced+by+influenza+virus.">Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus.</a> A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).</li><li>Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+ligands+are+expressed+on+stressed+human+airway+epithelial+cells.">NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costimulation+of+CD8alphabeta+T+cells+by+NKG2D+via+engagement+by+MIC+induced+on+virus-infected+cells.">Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells.</a> Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).</li><li>Obeidy, P., Sharland, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands.">NKG2D and its ligands.</a> Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).</li><li>Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Cells+From+Smokers+Modify+Dendritic+Cell+Responses+in+the+Context+of+Influenza+Infection+1.">Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1.</a> Am. J. Resp. Cell. , (2010).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+exposed+epithelial+cells+modify+co-cultured+natural+killer+cells.">Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells.</a> AJP Lung. , (2013).</li><li>Turi, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+activates+anion+exchange+protein+2+and+AP-1+in+airway+epithelial+cells.">Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).</li><li>Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+effects+of+antibacterials+on+human+Bronchial+epithelial+cells.">Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells.</a> Respir. Res. 10, 89 (2009).</li><li>Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cultures+of+human+airway+epithelium+from+nasal+scrapings+and+bronchial+brushings.">Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).</li><li>Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+differentiation+of+serially+passaged+normal+human+tracheobronchial+epithelial+cells.">Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).</li><li>Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Chamber+System+for+Maintaining+Differentiated+Guinea-Pig+Respiratory+Epithelial-Cells+between+Air+and+Liquid-Phases.">A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases.</a> Biotechniques. 5, 462 (1987).</li><li>Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biphasic+chamber+system+for+maintaining+polarity+of+differentiation+of+cultured+respiratory+tract+epithelial+cells.">A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).</li><li>Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+expression+of+IRF7+in+nasal+epithelial+cells+from+smokers+after+infection+with+influenza.">Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+exposed+epithelial+cells+modify+cocultured+natural+killer+cells.">Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).</li><li>Ochs, M., Weibel, E. R., Fishmanetal, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. 4, 23-69 (2008).</li><li>Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+Ozone+Modulates+Human+Airway+Protease/Antiprotease+Balance+Contributing+to+Increased+Influenza+A+Infection.">Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection.</a> PLoS ONE. 7, e35108 (2012).</li><li>Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+enhances+influenza+virus+infections+in+respiratory+epithelial+cells.">Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells.</a> Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).</li><li>Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+IL-8+expression+and+transcription+factor+binding+in+respiratory+epithelial+cells.">Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+grass+pollen+exposure.">Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure.</a> Eur. Respir. J. , (2012).</li><li>Bauer, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+enhances+caspase-1+in+bronchial+epithelial+cells+from+asthmatic+volunteers+and+is+associated+with+pathogenesis.">Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).</li><li>Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+stimulates+accumulation+of+gas+phase+nitric+oxide+in+differentiated+cultures+of+normal+and+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cells.">Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells.</a> Lung. 190, 563-571 (2012).</li><li>Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+microRNA+expression+in+human+airway+cells+by+diesel+exhaust+particles+is+linked+to+tumorigenesis-associated+pathways.">Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways.</a> Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).</li><li>Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Attenuated+Influenza+Virus+(LAIV)+induces+different+mucosal+T+cell+function+in+nonsmokers+and+smokers.">Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers.</a> Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).</li><li>Horvath, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lavage+natural+killer+cell+function+is+suppressed+in+smokers+after+live+attenuated+influenza+virus.">Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus.</a> Respir. Res. 12, 102 (2011).</li><li>Noah, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke+exposure+and+altered+nasal+responses+to+live+attenuated+influenza+virus.">Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus.</a> Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).</li></ol>

EC Respiratory niet alleen een fysieke barrière voor het menselijk lichaam te beschermen tegen exogene stimuli 20, maar ook als een schakelbord te initiëren en te reguleren respiratoire immuunsysteem responsen 1-3 via uitscheiding van oplosbare mediatoren of direct receptor-ligand cel-cel interacties. Om verdere analyse van de rol van EC in de immuunrespons op potentiaalverschillen tussen EC van zieke populaties te onderzoeken of de effecten van exogene stressoren EC bestuderen, is het belangrijk...

Doel van de techniek Epitheelcellen (EC) in de luchtwegen zijn een van de eerste sites die rechtstreeks worden blootgesteld aan geïnhaleerde negatieve milieu-invloeden, zoals ziektekiemen, allergenen of luchtverontreinigende stoffen. EC meer dan een structurele belemmering: Zij fungeren als een schakelbord via de afgifte van oplosbare mediators 4-6 en de expressie van liganden / receptoren op hun surfac 7-9 initiëren en reguleren de immuunrespons respiratoire 1-3. Terwijl geïmmortaliseerde cellijnen kunnen worden gebruikt als modellen voor respiratoire EC studie in vitro, ze niet differentiëren in heterogene celpopulaties uit gepolariseerde trilharen en slijm producerende cellen, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in vivo. Belangrijke kenmerken van de respiratoire epitheel waargenomen in vivo Resumerend kan worden primaire luchtweg EC gebruikt. Daarom is ons doel was om onze methode waarbij nasale EC (NEM) te optimaliseren verkregen uit menselijke vrijwilligers. De NEC&#39;s worden uitgebreid en in vitro gekweekt, wat een celcultuur model van gedifferentieerde NEC&#39;s die veel van de kenmerken van de nasale epitheel gezien in vivo nabootst. Motivering Het gebruik van in vitro modellen met menselijke primaire EC nabootsen in vivo situatie - zoals beschreven in deze studie - geeft unieke mogelijkheden ziekte specifieke verschillen van EC, fysiologische parameters geassocieerd met het luchtwegepitheel of de interacties tussen EC en andere celtypes te bestuderen, zoals dendritische cel 10, natural killer cellen 11 of macrofagen. Verschillende bestaande methoden maken gebruik van bronchiale EC, die invasief via borstel biopten kan worden verkregen tijdens bronchoscopies, of op een andere wijze weggegooid longweefsel 12-17. Bovendien, commerciële bronnen om volledig gedifferentieerde menselijke luchtwegen epitheelcelkweken verkrijgen bestaan ​​(EpiAirway model uit MatTek, Ashland, MA, Cloneticsvan Lonza, Bazel, Zwitserland, MucilAir van Epithelix Sars, Genève Zwitserland), waar onderzoekers kunnen kiezen uit verschillende donoren. Vanwege de beperkte pool van commercieel beschikbare epitheelcellen, beperkt of voorgeschreven set parameters, de kosten verbonden aan commercieel verkrijgen primaire menselijke luchtwegen EC en de beperkte toegang tot verwijderd longweefsel of pas verkregen humane bronchiale biopsie weefsel, verbieden vele onderzoekers van uitvoeren van onderzoek bij volledig gedifferentieerde menselijke luchtwegen EC. Daarom hebben we besloten om een ​​techniek die 1) zal gebruik maken van niet-invasief verkregen menselijke NEM, 2) een protocol waardoor culturen van gedifferentieerde menselijke luchtwegepitheel, en 3) zijn reproduceerbaar in de meeste lab instellingen met een bestaande weefselkweek infrastructuur te ontwikkelen. Voordelen ten opzichte van bestaande technieken / modellen Geweest nieuw NEC in vergelijking met bronchiale of kleine luchtwegen EC, is veel minder invasief, individueles kan meerdere keren worden biopsied zonder significante bijwerkingen, en oppervlakkige nasale schrapen biopten kunnen worden uitgevoerd in de zieke bevolking die anders niet in aanmerking zouden komen voor onderzoeksgerelateerde bronchoscopies. Niet-invasieve oppervlakkige schaaf biopten naar NEC te verkrijgen, zodat de onderzoeker om donor specificatie stellen a priori, zoals leeftijd, geslacht, status van de ziekte, enz., in overeenstemming met het doel van het onderzoek te worden uitgevoerd. Dus, bij het ontwerpen van onderzoeken onderzoekers zijn niet beperkt door klinisch beschikbaar weefsels / epitheliale specimen, kopen dure gedifferentieerde celcultuur modellen van commerciële leveranciers, of ontwerp invasieve bronchoscopie studies. Bovendien, het gemak om NEM verkrijgen vergroot de mogelijkheid om experimenten in cellen van verschillende donoren, die statistische validatie van de waargenomen resultaten verbetert. Ten slotte, de neus is een van de eerste sites die worden blootgesteld aan elke vorm van stressoren lucht overgedragen. Aldus genereren in organotypischevitro kweeksystemen nabootsen het nasale epitheel zijn nuttig voor het bestuderen inhalatie van virale deeltjes, stoffen, allergenen, of gassen, die gemakkelijk kan worden bereikt door deze celcultuur.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nasal speculum</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 22009</td>
 <td>9 mm, reusable polyproylene</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating otoscope</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 21700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhino probe cell cuvette</td>
 <td>Arlington Scientific</td>
 <td>SY-96-092</td>
 <td>bend the head of the cuvette a little more</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-well culture plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3512</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transwell membrane cell culture inserts</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3460</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flask </td>
 <td>Corning</td>
 <td>430639 and 430641</td>
 <td>T25 and T75 vented flask</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 media (with L-Glutamine)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11875</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Cell applications</td>
 <td>511-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3170</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25080</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NuSerum</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>355104</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAMBANKER freezing media</td>
 <td>BAMBANKER</td>
 <td>302-14681</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoolCell </td>
 <td>Biocision</td>
 <td>HTBCS-136</td>
 <td>(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureCol</td>
 <td>AdvancedBioMatrix</td>
 <td>5005-B</td>
 <td>dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 &mu;l/well of a 12-well plate</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS with Ca2 and Mg2+</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse 1</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>DN25</td>
 <td>Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 &mu;l to each ml of media</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200-056</td>
 <td>Use at it is</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td>Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retinoic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R7632</td>
 <td>Make it up 100 &mu;M stock solution (see below), dilute to 10 &mu;M with absolute alcohol, take 5 &mu;l of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). 
 
 All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its' dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 &deg;C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media.
 Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Pituitary Extract</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>13028-014</td>
 <td>Used for BEGM ALI media.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nystatin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N4014-50 mg</td>
 <td>Make up a solution of 3.3 mg/ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1600-100</td>
 <td>Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PneumaCult-ALI media</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>5001</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrocortisone </td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7904</td>
 <td>Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7980</td>
 <td>Use at it is. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter flasks (500 ml)</td>
 <td>Corning</td>
 <td>431097</td>
 <td>0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter tubes (50 ml)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>SCGP00525</td>
 <td>Steriflip, 0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette tips - ART Barrier Tips</td>
 <td>Molecular Bioproducts</td>
 <td>2139RI, 2069RI, 2179RI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ddH2O, absolute ethanol, ice</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>refrigerated centrifuge</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>biological safety cabinet</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>gloves</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>lab coat with tight cuffs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Media and solutions used:</td>
 <td>Recipe</td>
 <td>Used for</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">General remark: always warm the media to room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="2">BEGM media</td>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid</li></ul> </td>
 <td>(mix them half-half and filter )</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements </li></ul></td>
 <td><ul><li> digestion of the biopsy</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM+ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml BEGM media </li></ul></td>
 <td><ul><li> maintaining cells on plastic in the plates (passage0) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l retinoic acid (working solution)</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td><ul><li> maintain the cells in the flask </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM++ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml Lonza's BEGM media with supplements</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding fresh cells in 12-well plate on plastic</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Sodium BiCarb</li></ul> </td>
 <td><ul><li> maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2.5 ml NuSerum</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">BEGM ALI media</td>
 <td><ul><li> 250 ml DMEM-H </li></ul></td>
 <td rowspan="5"><ul><li> Maintaining cells on the transwell before they go ALI</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 250 ml BEGM including supplements</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 75 &mu;l BSA (10 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">200X Hydrocortisone Stock Solution (96 &mu;l/ml solution)</td>
 <td><ul><li> 200 &mu;l dissolved hydrocortisone</li></ul> </td>
 <td rowspan="5"><ul><li> As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 4250 &mu;l dissolved sodium chloride </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 540 &mu;l ddH2O</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l absolute ethanol</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter solution through 0.22 &mu;m filter, aliquot solution and store at -20 &deg;C, avoid additional freeze/thaw cycles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">PneumaCult-ALI Complete Base Media</td>
 <td><ul><li> 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium</li></ul> </td>
 <td><ul><li> Base medium for all three PneumaCult-ALI media </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 50 ml PneumaCult 10x Supplement </li></ul></td>
 <td><ul><li> The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(this is stable for 2 weeks at 2-8 &deg;C or for up to 6 months at -20 &deg;C)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="4">PneumaCult-ALI Maintenance Medium</td>
 <td>Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:</td>
 <td rowspan="4">ALI culture on inserts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l PneumaCult 100x Maintenance Supplement </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 &mu;l Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 5 &mu;l Hydrocortisone (of a 96 &mu;l/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface

In vitro-modellen met humane primaire epitheliale cellen zijn essentieel begrijpen belangrijkste functies van de respiratoire epitheel in het kader van microbiële infecties of geïnhaleerd middelen. Directe vergelijkingen van cellen verkregen van zieke populatie kunnen we verschillende fenotypes karakteriseren en ontleden de onderliggende mechanismen bemiddelen veranderingen in de epitheliale cel functie. Het kweken van epitheliale cellen van de humane tracheobronchiale gebied is goed gedocumenteerd, maar is beperkt door de beschikbaarheid van menselijk longweefsel of invasiviteit van de verkrijging van de bronchiale biopsieën borstels. Nasale epitheelcellen worden verkregen door middel van veel minder invasief oppervlakkige neus schrapen biopsieën en onderwerpen kan meerdere keren worden biopsied zonder significante bijwerkingen. Bovendien, de neus is het toegangspunt tot de luchtwegen en daarmee een van de eerste sites die worden blootgesteld aan elke vorm van lucht overgedragen stressor, zoals microbiële agentia, Verontreinigende stoffen of allergenen. In het kort, nasale epitheelcellen verkregen uit menselijke vrijwilligers worden uitgebreid op gecoate weefselkweek platen, en vervolgens overgebracht op celkweek inserts. Bij het bereiken van confluentie, cellen verder worden gekweekt bij de lucht-vloeistof-interface (ALI), enkele weken, met meer fysiologisch relevante omstandigheden schept. De ALI kweekomstandigheid gebruikt gedefinieerde media leidt tot een gedifferentieerd epitheel dat morfologische en functionele kenmerken vergelijkbaar met de menselijke nasale epitheel, met zowel trilharen en slijm producerende cellen vertoont. Weefselkweek inserts met gedifferentieerde nasale epitheelcellen kunnen worden gemanipuleerd op verschillende manieren, afhankelijk van de onderzoeksvragen (behandeling met farmacologische agentia, transductie met lentivirale vectoren, blootstelling aan gassen of infectie met microbiële agentia) en talrijke verschillende eindpunten vinden geanalyseerd cellulaire en moleculaire pathways, functionele changes, morfologie, enz. In vitro modellen van gedifferentieerde menselijke nasale epitheelcellen onderzoekers kunnen geven tot nieuwe en belangrijke vragen pakken met organotypische experimentele modellen die de nasale epitheel in vivo grotendeels bootsen.

NEC gekweekt volgens de hier beschreven protocol opnieuw differentiëren tot een heterogene laag EC uit trilharen en niet-haarcellen, die de situatie in vivo (figuur 1). Sommige van de gedifferentieerde NEC&#39;s zijn slijm produceren (cellen kleuring in blauw met AB / PAS, figuur 1B). Hoewel de hier gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd, kan differentiatie variëren met betrekking tot de verdeling van de totale cel populaties (verschillende verhoudingen van haarc...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface at JoVE.com

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Nasale epitheelcellen, verkregen door middel van oppervlakkige schaaf biopsie van menselijke vrijwilligers, worden uitgebreid en overgebracht naar weefselkweek inserts. Bij het bereiken van confluentie, worden cellen gekweekt bij lucht-water grensvlak, waardoor culturen van trilharen en niet-haarcellen. Gedifferentieerde nasale epitheelcelkweken voorzien levensvatbare experimentele modellen voor het bestuderen van de respiratoire mucosa.

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Een systeem voor het kweken van Iris pigment epitheelcellen aan Lens Regeneratie Study in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design and Development of AptamerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design and Development van aptameer-gouden nanodeeltjes gebaseerde Colorimetrisch Testen voor In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

De inname van TL, magnetische nanodeeltjes voor de bepaling van de vloeistof-opname capaciteiten in de insecten

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Een lucht-vloeistof interface bronchiale epitheel model voor realistische, herhaalde inhalatie blootstelling aan deeltjes in de lucht voor toxiciteit testen

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...