Name: culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface
Uploaded: 2013-10-08T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a Lisa Dailey para as entradas úteis. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (ES013611 e HL095163), o Flight Attendant Instituto de Pesquisa Médica (FAMRI) e da Agência de Proteção Ambiental (CR83346301) e declara não há conflito de interesse. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health. Embora a pesquisa descrita neste artigo foi financiado em parte pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA através de um acordo de cooperação CR83346301 com o Centro de Medicina Ambiental, Asma e Biologia pulmão da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill, que não tenha sido submetido ao A agência do exigido pelos pares e revisão de políticas e, portanto, não refletem necessariamente a opinião da agência, e nenhum endosso oficial deve ser inferida. Mencione onomes comerciais de f ou produtos comerciais não constituem endosso ou recomendação para o uso. Loretta Müller é apoiado pela National Science Foundation suíço com uma doação pessoal.

1. Prepare Plastic Ware: Brasão Placa <ol><li> Adicionar 500 ul PureCol (1:100 diluído em água esterilizada) para cada poço de uma placa de 12 poços. </li><li> Incubar a 37 ° C numa incubadora durante 30 min, remover o PureCol e enxagua-se com HBSS a direita antes as células são adicionadas à placa (ver passo 3.1). </li></ol> 2. Obtenção e pré-tratamento de Biópsia de CNE Humano <ol><li> Biópsia raspar Nasal <ol><li> Obter ECs superficiais que revestem os cornetos nasais sob vis...

<ol>
	<li>Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+decision+makers:+in+search+of+the+'epimmunome.">Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome.</a> Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses.">The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin. 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E., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+exposed+epithelial+cells+modify+cocultured+natural+killer+cells.">Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).</li><li>Ochs, M., Weibel, E. R., Fishmanetal, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. 4, 23-69 (2008).</li><li>Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+Ozone+Modulates+Human+Airway+Protease/Antiprotease+Balance+Contributing+to+Increased+Influenza+A+Infection.">Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection.</a> PLoS ONE. 7, e35108 (2012).</li><li>Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+enhances+influenza+virus+infections+in+respiratory+epithelial+cells.">Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells.</a> Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).</li><li>Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+IL-8+expression+and+transcription+factor+binding+in+respiratory+epithelial+cells.">Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+grass+pollen+exposure.">Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure.</a> Eur. Respir. J. , (2012).</li><li>Bauer, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+enhances+caspase-1+in+bronchial+epithelial+cells+from+asthmatic+volunteers+and+is+associated+with+pathogenesis.">Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).</li><li>Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+stimulates+accumulation+of+gas+phase+nitric+oxide+in+differentiated+cultures+of+normal+and+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cells.">Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells.</a> Lung. 190, 563-571 (2012).</li><li>Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+microRNA+expression+in+human+airway+cells+by+diesel+exhaust+particles+is+linked+to+tumorigenesis-associated+pathways.">Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways.</a> Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).</li><li>Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Attenuated+Influenza+Virus+(LAIV)+induces+different+mucosal+T+cell+function+in+nonsmokers+and+smokers.">Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers.</a> Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).</li><li>Horvath, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lavage+natural+killer+cell+function+is+suppressed+in+smokers+after+live+attenuated+influenza+virus.">Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus.</a> Respir. Res. 12, 102 (2011).</li><li>Noah, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke+exposure+and+altered+nasal+responses+to+live+attenuated+influenza+virus.">Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus.</a> Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).</li></ol>

ECs respiratórias fornecer não apenas uma barreira física para proteger o corpo humano a partir de estímulos exógenos 20, mas também funcionam como uma central para iniciar e regular as respostas de defesa imunológico respiratórias 1-3 através da secreção de mediadores solúveis ou interações célula-célula receptor-ligante diretos. A fim de estudar melhor o papel das células endoteliais na resposta imune, para examinar as diferenças de potencial entre os CEs a partir de populaçõe...

Objetivo da técnica As células epiteliais (ECS) nas vias aéreas estão entre os primeiros locais a serem diretamente expostos a estressores ambientais inalados, tais como patógenos, alérgenos ou poluentes atmosféricos. ECs são mais do que uma barreira estrutural: Eles agem como uma central para iniciar e regular a resposta imune respiratório 1-3 através da liberação de mediadores solúveis 4-6 ea expressão de ligantes / receptores em sua surfac 7-9. Enquanto as linhas de células imortalizadas podem ser utilizados como modelos para estudar CEs respiratórias in vitro, eles não conseguem diferenciar-se em populações de células heterogéneas compostos de ciliado polarizada e as células produtoras de muco, semelhante ao que se observa in vivo. Para recapitular características importantes do epitélio respiratório observada in vivo, os CEs das vias primárias podem ser usadas. Portanto, nosso objetivo foi otimizar o nosso método utilizando nasal ECs (CNE) obtido de voluntários humanos. Os CNE são expandidas e cultivadas in vitro, produzindo um modelo de cultura de células de CNE diferenciadas que imita muitas das características do epitélio nasal visto in vivo. Análise racional O uso de modelos in vitro com células endoteliais humanas primárias imitando em situação vivo - como descrito neste estudo - dá possibilidades únicas para estudar diferenças de doenças específicas de ECs, parâmetros fisiológicos associados com o epitélio das vias aéreas, ou as interações entre células endoteliais e outros tipos de células, tais como células dendríticas 10, células natural killer 11 ou macrófagos. Vários métodos existentes utilizam CEs brônquicas, que podem ser obtidas de forma invasiva por meio de biópsias da escova durante broncoscopia, ou a partir de tecido de pulmão de outra forma descartadas 12-17. Além disso, as fontes comerciais para a obtenção de culturas de células das vias respiratórias humanas epiteliais completamente diferenciadas existir (modelo EpiAirway da MatTek, Ashland, MA, Cloneticsda Lonza, Basiléia, Suíça, a partir MucilAir Epithelix Sars, Genebra Suíça), onde os investigadores podem escolher entre diferentes doadores. No entanto, por causa do conjunto limitado de células epiteliais disponíveis comercialmente, ou limitadas conjunto prescrito de parâmetros, o custo associado com a obtenção comercialmente vias respiratórias humanas primárias ECs, e o acesso limitado a tecido pulmonar ou tecido descartado biópsia brônquica humana recentemente obtida, proibir muitos investigadores da realização de estudos em ECs vias aéreas humano totalmente diferenciadas. Por isso, nos propusemos a desenvolver uma técnica que irá 1) utilizar CNE humanos não-invasiva obtidos, 2) fornecer um protocolo produzindo culturas do epitélio das vias aéreas humano diferenciado, e 3) ser reprodutível na maioria dos ambientes de laboratório com uma infra-estrutura de cultura de tecido existente. Vantagens sobre as técnicas existentes / Modelos Obtenção CNE frescos, em comparação com brônquica ou pequenas vias aéreas ECs, é muito menos invasivo, individuaiss pode ser biópsia várias vezes, sem efeitos colaterais significativos, e superficiais biópsias raspar nasais podem ser realizadas em populações doentes que de outra forma não se qualificariam para bronchoscopies relacionadas com a investigação. Não-invasivos biópsias raspar superficiais para obter CNE permitir que o investigador para definir especificação doador a priori, incluindo idade, sexo, estado da doença, etc, de acordo com o objetivo da pesquisa a ser realizada. Assim, ao projetar estudos de investigação investigadores não estão limitados pelos tecidos clinicamente disponíveis / amostras epiteliais, comprar modelos de cultura de células diferenciadas caros de fornecedores comerciais, ou de projeto de broncoscopia estudos invasivos. Além disso, a facilidade de obter CNE aumenta a capacidade de realizar as experiências em células a partir de doadores diferentes, o que aumenta a validação estatística dos resultados observados. Por último, o nariz é um dos primeiros locais a serem expostas a qualquer tipo de estressores transmitidas pelo ar. Assim, a geração de organotípicas emsistemas de cultura in vitro que imitam o epitélio nasal são úteis para o estudo de inalação de partículas virais, poluentes, alérgeno, ou gases, que podem ser facilmente obtidos pela utilização deste sistema de cultura de células.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nasal speculum</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 22009</td>
 <td>9 mm, reusable polyproylene</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating otoscope</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 21700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhino probe cell cuvette</td>
 <td>Arlington Scientific</td>
 <td>SY-96-092</td>
 <td>bend the head of the cuvette a little more</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-well culture plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3512</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transwell membrane cell culture inserts</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3460</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flask </td>
 <td>Corning</td>
 <td>430639 and 430641</td>
 <td>T25 and T75 vented flask</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 media (with L-Glutamine)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11875</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Cell applications</td>
 <td>511-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3170</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25080</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NuSerum</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>355104</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAMBANKER freezing media</td>
 <td>BAMBANKER</td>
 <td>302-14681</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoolCell </td>
 <td>Biocision</td>
 <td>HTBCS-136</td>
 <td>(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureCol</td>
 <td>AdvancedBioMatrix</td>
 <td>5005-B</td>
 <td>dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 &mu;l/well of a 12-well plate</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS with Ca2 and Mg2+</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse 1</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>DN25</td>
 <td>Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 &mu;l to each ml of media</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200-056</td>
 <td>Use at it is</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td>Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retinoic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R7632</td>
 <td>Make it up 100 &mu;M stock solution (see below), dilute to 10 &mu;M with absolute alcohol, take 5 &mu;l of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). 
 
 All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its' dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 &deg;C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media.
 Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Pituitary Extract</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>13028-014</td>
 <td>Used for BEGM ALI media.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nystatin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N4014-50 mg</td>
 <td>Make up a solution of 3.3 mg/ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1600-100</td>
 <td>Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PneumaCult-ALI media</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>5001</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrocortisone </td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7904</td>
 <td>Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7980</td>
 <td>Use at it is. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter flasks (500 ml)</td>
 <td>Corning</td>
 <td>431097</td>
 <td>0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter tubes (50 ml)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>SCGP00525</td>
 <td>Steriflip, 0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette tips - ART Barrier Tips</td>
 <td>Molecular Bioproducts</td>
 <td>2139RI, 2069RI, 2179RI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ddH2O, absolute ethanol, ice</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>refrigerated centrifuge</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>biological safety cabinet</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>gloves</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>lab coat with tight cuffs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Media and solutions used:</td>
 <td>Recipe</td>
 <td>Used for</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">General remark: always warm the media to room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="2">BEGM media</td>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid</li></ul> </td>
 <td>(mix them half-half and filter )</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements </li></ul></td>
 <td><ul><li> digestion of the biopsy</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM+ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml BEGM media </li></ul></td>
 <td><ul><li> maintaining cells on plastic in the plates (passage0) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l retinoic acid (working solution)</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td><ul><li> maintain the cells in the flask </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM++ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml Lonza's BEGM media with supplements</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding fresh cells in 12-well plate on plastic</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Sodium BiCarb</li></ul> </td>
 <td><ul><li> maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2.5 ml NuSerum</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">BEGM ALI media</td>
 <td><ul><li> 250 ml DMEM-H </li></ul></td>
 <td rowspan="5"><ul><li> Maintaining cells on the transwell before they go ALI</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 250 ml BEGM including supplements</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 75 &mu;l BSA (10 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">200X Hydrocortisone Stock Solution (96 &mu;l/ml solution)</td>
 <td><ul><li> 200 &mu;l dissolved hydrocortisone</li></ul> </td>
 <td rowspan="5"><ul><li> As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 4250 &mu;l dissolved sodium chloride </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 540 &mu;l ddH2O</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l absolute ethanol</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter solution through 0.22 &mu;m filter, aliquot solution and store at -20 &deg;C, avoid additional freeze/thaw cycles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">PneumaCult-ALI Complete Base Media</td>
 <td><ul><li> 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium</li></ul> </td>
 <td><ul><li> Base medium for all three PneumaCult-ALI media </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 50 ml PneumaCult 10x Supplement </li></ul></td>
 <td><ul><li> The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(this is stable for 2 weeks at 2-8 &deg;C or for up to 6 months at -20 &deg;C)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="4">PneumaCult-ALI Maintenance Medium</td>
 <td>Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:</td>
 <td rowspan="4">ALI culture on inserts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l PneumaCult 100x Maintenance Supplement </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 &mu;l Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 5 &mu;l Hydrocortisone (of a 96 &mu;l/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface

Os modelos in vitro utilizando células epiteliais primárias humanas são essenciais para a compreensão das principais funções do epitélio respiratório no contexto de infecções microbianas ou agentes inalados. Comparações diretas de células obtidas de populações doentes nos permitem caracterizar diferentes fenótipos e dissecar os mecanismos subjacentes mediando mudanças na função da célula epitelial. A cultura de células epiteliais da região traqueobrônquica humana tem sido bem documentada, mas é limitado pela disponibilidade de tecido de pulmão humano ou invasividade relacionado com a obtenção das escovas biópsias brônquicas. Células epiteliais nasais são obtidos através de biópsias superficiais raspar nasal muito menos invasivos e os assuntos podem ser biopsiados várias vezes, sem efeitos colaterais significativos. Além disso, o nariz é o ponto de entrada para o sistema respiratório e, portanto, um dos primeiros locais a serem expostas a qualquer tipo de estressor transportada pelo ar, como agentes microbianos, poluentes, ou alérgenos. Resumidamente, as células epiteliais nasais obtidos a partir de voluntários humanos são expandidos em placas de cultura de tecidos revestidos, e em seguida transferida para inserções de cultura de células. Ao atingir a confluência, as células continuam a ser cultivadas na interface ar-líquido (ALI), durante várias semanas, o que cria condições mais fisiologicamente relevantes. A condição cultura ALI usa a mídia definidas levando a um epitélio diferenciado que apresenta características morfológicas e funcionais semelhantes ao epitélio nasal humano, com células ciliadas e mucosas tanto produzindo. Inserções de cultura de tecidos com células epiteliais nasais diferenciadas pode ser manipulado numa variedade de maneiras dependendo das questões de pesquisa (tratamento com agentes farmacológicos, de transdução com vectores lentivirais, a exposição a gases, ou infecção com agentes microbianos) e analisados ​​por numerosos pontos de extremidade diferentes, desde caminhos celulares e moleculares, ch funcionalanges, morfologia, etc Em modelos in vitro de células epiteliais nasais humanos diferenciados permitirá que os investigadores a abordar novas e importantes questões de pesquisa, utilizando modelos experimentais organotípicas que grande parte imitar o epitélio nasal in vivo.

CNE cultivadas seguindo o protocolo aqui descrito re-diferenciar-se em uma camada de células endoteliais heterogéneo composto por células ciliadas e não ciliadas, que representam a situação in vivo (Figura 1). Alguns dos CNE diferenciadas são muco produtores (células marcadas em azul usando AB / PAS, Figura 1B). Embora o protocolo aqui apresentado é optimizada, a diferenciação pode variar no que diz respeito à distribuição das populações totais de células (...

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Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Biologia

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Um sistema para a cultura de células epiteliais pigmentadas da íris para estudo da regeneração Lens em Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

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Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo

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The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

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Um modelo epitelial de interface ar-líquido para exposição de inalação realista e repetida a partículas aéreas para testes de toxicidade

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...