Name: culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface
Uploaded: 2013-10-08T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface at JoVE.com

Författarna vill tacka Lisa Dailey för hjälpingångarna. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (ES013611 och HL095163), Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI) och Naturvårdsverket (CR83346301) och förklarar ingen intressekonflikt. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health. Även den forskning som beskrivs i den här artikeln har finansierats delvis av US Environmental Protection Agency genom samarbetsavtal CR83346301 med Centrum för miljömedicin, Astma-och Lung biologi vid University of North Carolina-Chapel Hill, har det inte varit föremål för den byråns krävs inbördes och översyn av politiken och därför inte nödvändigtvis åsikterna hos myndigheten, och inget officiellt godkännande oavsiktliga. Nämn onamn f handel eller kommersiella produkter innebär inte stöds eller rekommenderas för användning. Loretta Müller stöds av Swiss National Science Foundation med ett personligt stipendium.

1. Förbered Plast Ware: Coat Plate <ol><li> Addera 500 pl PureCol (1:100 spädd med sterilt vatten) till varje brunn i en 12-brunnars platta. </li><li> Inkubera vid 37 ° C i en inkubator i 30 minuter, ta bort PureCol och skölj med HBSS precis innan cellerna tillsätts till plattan (se steg 3.1). </li></ol> 2. Att få och förbehandla Biopsi av Human NEC <ol><li> Nasal scrape biopsi <ol><li> Skaffa ytliga EC kantar nasala näsmusslan under direkt vision genom en 9 mm återanvändningsbar po...

<ol>
	<li>Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+decision+makers:+in+search+of+the+'epimmunome.">Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome.</a> Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses.">The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).</li><li>Muller, L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cells,+the+"switchboard"+of+respiratory+immune+defense+responses:+Effects+of+air+pollutants.">Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants.</a> Swiss Med. Wkly. , (2012).</li><li>Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+epithelial+cells+in+innate+immunity+to+influenza+virus+infection.">Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection.</a> Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).</li><li>Robertson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chemokines+in+the+biology+of+natural+killer+cells.">Role of chemokines in the biology of natural killer cells.</a> J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).</li><li>Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cytokines+on+human+bronchial+epithelial+cells+induced+by+influenza+virus.">Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus.</a> A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).</li><li>Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+ligands+are+expressed+on+stressed+human+airway+epithelial+cells.">NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).</li><li>Groh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costimulation+of+CD8alphabeta+T+cells+by+NKG2D+via+engagement+by+MIC+induced+on+virus-infected+cells.">Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells.</a> Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).</li><li>Obeidy, P., Sharland, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands.">NKG2D and its ligands.</a> Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).</li><li>Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Cells+From+Smokers+Modify+Dendritic+Cell+Responses+in+the+Context+of+Influenza+Infection+1.">Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1.</a> Am. J. Resp. Cell. , (2010).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+exposed+epithelial+cells+modify+co-cultured+natural+killer+cells.">Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells.</a> AJP Lung. , (2013).</li><li>Turi, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+activates+anion+exchange+protein+2+and+AP-1+in+airway+epithelial+cells.">Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).</li><li>Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+effects+of+antibacterials+on+human+Bronchial+epithelial+cells.">Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells.</a> Respir. Res. 10, 89 (2009).</li><li>Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cultures+of+human+airway+epithelium+from+nasal+scrapings+and+bronchial+brushings.">Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).</li><li>Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+differentiation+of+serially+passaged+normal+human+tracheobronchial+epithelial+cells.">Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).</li><li>Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Chamber+System+for+Maintaining+Differentiated+Guinea-Pig+Respiratory+Epithelial-Cells+between+Air+and+Liquid-Phases.">A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases.</a> Biotechniques. 5, 462 (1987).</li><li>Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biphasic+chamber+system+for+maintaining+polarity+of+differentiation+of+cultured+respiratory+tract+epithelial+cells.">A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).</li><li>Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+expression+of+IRF7+in+nasal+epithelial+cells+from+smokers+after+infection+with+influenza.">Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).</li><li>Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone+exposed+epithelial+cells+modify+cocultured+natural+killer+cells.">Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).</li><li>Ochs, M., Weibel, E. R., Fishmanetal, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. 4, 23-69 (2008).</li><li>Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+Ozone+Modulates+Human+Airway+Protease/Antiprotease+Balance+Contributing+to+Increased+Influenza+A+Infection.">Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection.</a> PLoS ONE. 7, e35108 (2012).</li><li>Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+enhances+influenza+virus+infections+in+respiratory+epithelial+cells.">Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells.</a> Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).</li><li>Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+IL-8+expression+and+transcription+factor+binding+in+respiratory+epithelial+cells.">Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).</li><li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+grass+pollen+exposure.">Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure.</a> Eur. Respir. J. , (2012).</li><li>Bauer, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+enhances+caspase-1+in+bronchial+epithelial+cells+from+asthmatic+volunteers+and+is+associated+with+pathogenesis.">Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).</li><li>Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+stimulates+accumulation+of+gas+phase+nitric+oxide+in+differentiated+cultures+of+normal+and+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cells.">Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells.</a> Lung. 190, 563-571 (2012).</li><li>Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+microRNA+expression+in+human+airway+cells+by+diesel+exhaust+particles+is+linked+to+tumorigenesis-associated+pathways.">Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways.</a> Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).</li><li>Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Attenuated+Influenza+Virus+(LAIV)+induces+different+mucosal+T+cell+function+in+nonsmokers+and+smokers.">Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers.</a> Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).</li><li>Horvath, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+lavage+natural+killer+cell+function+is+suppressed+in+smokers+after+live+attenuated+influenza+virus.">Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus.</a> Respir. Res. 12, 102 (2011).</li><li>Noah, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke+exposure+and+altered+nasal+responses+to+live+attenuated+influenza+virus.">Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus.</a> Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).</li></ol>

Andnings EC ger inte bara en fysisk barriär för att skydda kroppen från exogena stimuli 20, men också fungera som en växel för att initiera och reglera andnings immunförsvar svar 1-3 via utsöndring av lösliga mediatorer eller direkta receptor-ligand-cell-cell interaktioner. För att ytterligare studera betydelsen av EC i immunsvaret, för att undersöka eventuella skillnader mellan EC från sjuka populationer, eller för att studera effekterna av exogena faktorer på EC, är det viktigt at...

Mål av tekniken Epitelceller (ECS) i luftvägarna är bland de första platserna som direkt utsatta för inhalerade miljöpåverkande faktorer, såsom patogener, allergener och luftföroreningar. EC är mer än ett strukturellt hinder: De fungerar som en växel för att initiera och reglera luftvägarna immunsvar 1-3 via frisättningen av lösliga mediatorer 4-6 och uttrycket av ligander / receptorer på sin yt 7-9. Medan odödliga cellinjer kan användas som modeller för att studera andnings EC in vitro, misslyckas de att differentieras till heterogena cellpopulationer som består av polariserad cilierade och slemproducerande celler, liknande det som observerats in vivo. För att sammanfatta viktiga egenskaper hos det respiratoriska epitelet observerats in vivo, kan primära luftvägs EC användas. Därför är vårt mål var att optimera vår metod utnyttjar nasal EC (NEC) som erhållits från frivilliga. The NEC expanderas och odlas in vitro, vilket gav en cellkulturmodell för differentierade NEC som härmar många av funktionerna i det nasala epitelet ses in vivo. Bakgrund Användningen av in vitro-modeller med humana primära EC härma in vivo-situation - som beskrivs i denna studie - ger unika möjligheter att studera sjukdomsspecifika skillnader i EC, fysiologiska parametrar i samband med luftvägsslemhinnan, eller växelverkan mellan EC och andra celltyper, såsom dendritiska celler 10, naturliga mördarceller 11 eller makrofager. Flera befintliga metoder utnyttjar luftrörs EC, som kan erhållas invasivt via borst biopsier under bronchoscopies, eller från något annat kasslungvävnad 12-17. Dessutom kommersiella källor för att få fullt differentierade mänskliga luftvägarna epitelial cellkulturer existerar (EpiAirway modell från Mattek, Ashland, MA, Cloneticsfrån Lonza, Basel, Schweiz, MucilAir från Epithelix Sars, Genève Schweiz), där utredarna kan välja mellan olika givare. Men på grund av den begränsade pool av kommersiellt tillgängliga epitelceller, begränsade eller föreskriven uppsättning parametrar, kostnaden i samband med kommersiellt erhålla primära humana luftvägar EC, och den begränsade tillgången till kasselungvävnad eller nyligen erhållna human bronkial biopsivävnad, förbjuda många utredare från studier på fullt differentierade mänskliga luftvägs EC. Därför har vi på att utveckla en teknik som kommer att 1) ​​använda icke-invasivt erhållna humana NEC, 2) ge ett protokoll som ger kulturer av differentierad mänsklig luftvägsepitel, och 3) vara reproducerbar i de flesta lab inställningar med en befintlig vävnadskultur infrastruktur. Fördelar jämfört med existerande tekniker / modeller Erhållande färska NEC, jämfört med bronkial eller små luftvägar EC, är mycket mindre invasiva, individuells kan biopsier flera gånger utan några betydande biverkningar, och ytliga nasala skrap biopsier kan utföras på sjuka populationer som annars inte skulle vara kvalificerade för forskningsrelaterade bronchoscopies. Icke-invasiv ytliga skrap biopsier att få NEC tillåter forskaren att ställa donator specifikation a priori, inklusive ålder, kön, sjukdomsstatus, etc. i enlighet med forsknings mål som skall uppnås. Alltså, när man utformar forskningsstudier utredare inte begränsas av kliniskt tillgängliga vävnader / epiteliala prov, köpa dyra differentierade cellkulturmodeller från kommersiella leverantörer, eller design invasiva bronkoskopi studier. Dessutom den lätthet att erhålla NEC ökar förmågan att genomföra experiment i celler från olika givare, vilket förbättrar statistisk validering av observerade undersökningsresultat. Slutligen är näsan en av de första platserna att utsättas för någon form av luftburna stressfaktorer. Således genere organotypisk iodlings vitro-system som härmar det nasala epitelet är användbara för att studera inandning av virala partiklar, föroreningar, allergener, eller gaser, som lätt kan uppnås genom användning av denna cellkultursystem.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nasal speculum</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 22009</td>
 <td>9 mm, reusable polyproylene</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating otoscope</td>
 <td>Welch Allyn</td>
 <td>Model 21700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhino probe cell cuvette</td>
 <td>Arlington Scientific</td>
 <td>SY-96-092</td>
 <td>bend the head of the cuvette a little more</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-well culture plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3512</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transwell membrane cell culture inserts</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3460</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flask </td>
 <td>Corning</td>
 <td>430639 and 430641</td>
 <td>T25 and T75 vented flask</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 media (with L-Glutamine)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11875</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Cell applications</td>
 <td>511-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3170</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25080</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NuSerum</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>355104</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAMBANKER freezing media</td>
 <td>BAMBANKER</td>
 <td>302-14681</td>
 <td>Use as it is.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoolCell </td>
 <td>Biocision</td>
 <td>HTBCS-136</td>
 <td>(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureCol</td>
 <td>AdvancedBioMatrix</td>
 <td>5005-B</td>
 <td>dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 &mu;l/well of a 12-well plate</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS with Ca2 and Mg2+</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse 1</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>DN25</td>
 <td>Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 &mu;l to each ml of media</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200-056</td>
 <td>Use at it is</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T6522</td>
 <td>Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retinoic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R7632</td>
 <td>Make it up 100 &mu;M stock solution (see below), dilute to 10 &mu;M with absolute alcohol, take 5 &mu;l of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). 
 
 All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its' dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 &deg;C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media.
 Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Pituitary Extract</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>13028-014</td>
 <td>Used for BEGM ALI media.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nystatin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N4014-50 mg</td>
 <td>Make up a solution of 3.3 mg/ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1600-100</td>
 <td>Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PneumaCult-ALI media</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>5001</td>
 <td>This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrocortisone </td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7904</td>
 <td>Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>7980</td>
 <td>Use at it is. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter flasks (500 ml)</td>
 <td>Corning</td>
 <td>431097</td>
 <td>0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter tubes (50 ml)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>SCGP00525</td>
 <td>Steriflip, 0.22 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette tips - ART Barrier Tips</td>
 <td>Molecular Bioproducts</td>
 <td>2139RI, 2069RI, 2179RI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ddH2O, absolute ethanol, ice</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>refrigerated centrifuge</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>biological safety cabinet</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>gloves</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>lab coat with tight cuffs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Media and solutions used:</td>
 <td>Recipe</td>
 <td>Used for</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">General remark: always warm the media to room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="2">BEGM media</td>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid</li></ul> </td>
 <td>(mix them half-half and filter )</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements </li></ul></td>
 <td><ul><li> digestion of the biopsy</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM+ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml BEGM media </li></ul></td>
 <td><ul><li> maintaining cells on plastic in the plates (passage0) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l retinoic acid (working solution)</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td><ul><li> maintain the cells in the flask </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">BEGM++ media</td>
 <td><ul><li> 50 ml Lonza's BEGM media with supplements</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding fresh cells in 12-well plate on plastic</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Sodium BiCarb</li></ul> </td>
 <td><ul><li> maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2.5 ml NuSerum</li></ul> </td>
 <td><ul><li> seeding cells in the flask (passage1; partially)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">BEGM ALI media</td>
 <td><ul><li> 250 ml DMEM-H </li></ul></td>
 <td rowspan="5"><ul><li> Maintaining cells on the transwell before they go ALI</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 250 ml BEGM including supplements</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 75 &mu;l BSA (10 mg/ml solution)</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="5">200X Hydrocortisone Stock Solution (96 &mu;l/ml solution)</td>
 <td><ul><li> 200 &mu;l dissolved hydrocortisone</li></ul> </td>
 <td rowspan="5"><ul><li> As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 4250 &mu;l dissolved sodium chloride </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 540 &mu;l ddH2O</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l absolute ethanol</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter solution through 0.22 &mu;m filter, aliquot solution and store at -20 &deg;C, avoid additional freeze/thaw cycles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">PneumaCult-ALI Complete Base Media</td>
 <td><ul><li> 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium</li></ul> </td>
 <td><ul><li> Base medium for all three PneumaCult-ALI media </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 50 ml PneumaCult 10x Supplement </li></ul></td>
 <td><ul><li> The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark</li></ul> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(this is stable for 2 weeks at 2-8 &deg;C or for up to 6 months at -20 &deg;C)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="4">PneumaCult-ALI Maintenance Medium</td>
 <td>Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:</td>
 <td rowspan="4">ALI culture on inserts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 10 &mu;l PneumaCult 100x Maintenance Supplement </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 2 &mu;l Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td><ul><li> 5 &mu;l Hydrocortisone (of a 96 &mu;l/ml stock solution) </li></ul></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface

In vitro-modeller med humana primära epitelceller är väsentliga för att förstå viktiga funktioner av respiratoriska epitelet i samband med mikrobiella infektioner eller inhalerade medel. Direkta jämförelser av celler från sjuka populationer tillåter oss att karakterisera olika fenotyper och dissekera de bakomliggande mekanismerna som förmedlar förändringar i epitelceller funktion. Odling epitelceller från human tracheobronchial regionen är väl dokumenterad, men begränsas av tillgången på lungvävnad eller humant invasivt i samband med att få bronkerna borstar biopsier. Nasala epitelceller erhålls genom mycket mindre invasiva ytliga nasal skrapa biopsier och ämnen kan biopsier flera gånger utan några signifikanta biverkningar. Dessutom är näsan inkörsport för luftvägarna och därmed en av de första platserna att utsättas för någon form av luftburna stressfaktor, t.ex. mikrobiella medel, föroreningar eller allergener. I korthet är nasala epitelceller som erhållits från frivilliga människor expanderat på belagda vävnadsodlingsplattor, och sedan överförs till cellkulturinsatser. Vid ankomsten till konfluens, celler fortsätter att odlas på luft-vätske-gränssnitt (ALI), i flera veckor, vilket skapar mer fysiologiskt relevanta förhållanden. Den ALI kultur villkoret använder definierade medier leder till en differentierad epitel som uppvisar morfologiska och funktionella egenskaper som liknar den mänskliga nässlemhinnan, med både cilie och slemproducerande celler. Vävnadsodlings skär med differentierade nasala epitelceller kan manipuleras i en mängd olika sätt beroende på forskningsfrågor (behandling med farmakologiska medel, transduktion med Lentiviral vektorer, exponering för gaser eller infektion med mikrobiella medel) och analyserades för många olika slutpunkter som sträcker sig från cellulära och molekylära vägar, funktionell lmAnges, morfologi etc. In vitro-modeller av differentierade humana nasala epitelceller kommer att göra det möjligt för utredarna att ta itu med nya och viktiga forskningsfrågor med hjälp organotypic experimentella modeller som i stor utsträckning efterlikna nässlemhinnan in vivo.

NEC odlade efter det här beskrivna protokollet åter differentiera till en heterogen lager av EC består av cilierade och icke-cilierade celler, som representerar in vivo-situationen (figur 1). Några av de differentierade NEC är slem som producerar (celler färgning i blått med hjälp av AB / PAS, Figur 1B). Även om den här presenterade protokollet optimeras, kan differentiering variera med avseende på fördelningen av de totala cellpopulationer (dvs. olika för...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface at JoVE.com

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Nasala epitelceller, som erhållits genom ytliga skrap biopsi av frivilliga försökspersoner, expanderas och överförs till vävnadskulturinsatser. Vid ankomsten till konfluens odlas celler vid luft flytande gränssnitt, vilket ger kulturer av cilierade och icke-cilierade celler. Differentierade nasala epitelceller cellkulturer ger livskraftiga experimentella modeller för att studera luftvägarna slemhinna.

Odling av Human Nasal epitelceller på Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primär mänskliga Bronkial epitelceller vuxit från explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Ett system för odling Iris Pigment epitelceller att studera Lens Regenerering vid Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescens Imaging med One-nanometer Noggrannhet (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

En metod för att välja Struktur-växling Aptamerer Tillämpat på en kolorimetrisk Gold nanopartiklar analys

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design and Development of AptamerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

Design och utveckling av aptamer-guld nanopartiklar baserade kolorimetriska analyser för in-the-fältet Program

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Intag av lysrör, magnetiska nanopartiklar för att bestämma vätska-upptag förmågor hos insekter

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasal potentialskillnaden att kvantifiera Trans-epitelial Ion Transport i möss

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Ett luft-flytande gränssnitt Bronchial Epitelial Modell för realistisk, upprepad inandningsexponering för luftburna partiklar för toxicitetstestning

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...