Name: culturing microglia from the neonatal and adult central nervous system
Uploaded: 2013-08-09T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System at JoVE.com

Vorremmo ringraziare i membri del Tsirka laboratorio per i loro consigli e utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto da R01NS42168 a SET, 12PRE12060489 a RB, un NSF-3MT IGERT e un Turner Tesi borsa di studio a LT, e NSF-3MT IGERT a JCN.

1. Dissection (giorno 0) <ol><li> Indurre l&#39;anestesia per p0-2 cuccioli di topo con ipotermia. Pulire le teste dei cuccioli con un Kimwipe imbevuto di etanolo al 70% per disinfettare il tessuto. </li><li> Togliere le teste con un paio di forbici, con 4 cuccioli per 10 cm piastra di coltura. Mettere le teste in una capsula di Petri contenente tampone di ghiaccio-freddo Hank. </li><li> Ancorare le testine utilizzando pinze curve attraverso le orbite e rimuovere con attenzione la pelle che ricopre il cranio con micro...

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Physiology:+Unique+Stimuli,+Specialized+Responses.">Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Kraft, A. D., Harry, G. 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E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+inflammation+in+the+brain+and+spinal+cord+following+mechanical+injury.">Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury.</a> J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).</li><li>Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ex+vivo+nitric+oxide+production+by+acutely+isolated+neonatal+and+adult+microglia.">Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia.</a> J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).</li><li>Brannan, C. A., Roberts, M. 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K., Fenesan, D., Malcangio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).</li><li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state.">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).</li><li>Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+regulate+the+number+of+functional+synapses.">Microglia actively regulate the number of functional synapses.</a> PLoS One. 8, e56293 (2013).</li><li>Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+microglia+in+synaptic+plasticity.">A role for microglia in synaptic plasticity.</a> Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).</li><li>DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+microglial+phagocytosis+of+senile+plaque+cores+of+Alzheimer's+disease.">Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease.</a> Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).</li><li>Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Men&#233;ndez Iglesias, B., Adorini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-12+production+by+central+nervous+system+microglia+is+inhibited+by+astrocytes.">IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes.</a> J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).</li><li>Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+induce+hemeoxygenase-1+expression+in+microglia:+a+feasible+mechanism+for+preventing+excessive+brain+inflammation.">Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation.</a> J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).</li><li>Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101, 1155-1163 (2003).</li><li>Ekdahl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+-+tuning+and+pruning+adult+neurogenesis.">Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis.</a> Front Pharmacol. 3, 14 (2012).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55, 412-424 (2007).</li></ol>

Microglia modulare CNS normale funzionamento così come le risposte infiammatorie a diverse patologie. Funzionale rimodellamento sinaptico da microglia è stata implicata nel mantenimento dell&#39;omeostasi normale del cervello 15. Durante la cascata neurogena partecipano alla liquidazione di cellule progenitrici neurali del giro dentato dell&#39;ippocampo 4, 16. Pertanto, è necessario sviluppare un sistema di coltura in cui studiare microglia neonatale e adulto, che coprirà la vasta fascia di sv...

Microglia sono le cellule immunitarie residenti del SNC, maggiormente somiglianti macrofagi periferici per struttura e funzione 1. E &#39;stato recentemente dimostrato che le cellule microgliali postnatali derivano da progenitori mieloidi primitivi e sono generati prima dell&#39;ottavo giorno di embriogenesi, rovesciando il concetto precedente che postnatali progenitori emopoietici sono la fonte della microglia nel cervello adulto 2. Essi giocano un ruolo chiave in diverse malattie neurologiche e possono rispondere rapidamente alle infezioni o lesioni attraverso il rilascio di citochine pro-infiammatorie e anti-infiammatori 3. Così microglia comprendono una unità autonoma nel SNC che possono essere manipolati per influenzare la progressione della malattia. Lo sviluppo di metodi robusti e riproducibili per isolare e coltivare le cellule microgliali neonatali o adulto è importante per gli studi futuri. Microglia sono noti per essere giocatori critici in un certo numero di patologie cerebrali. Più di recente, roles stanno emergendo per le cellule nel normale sviluppo del cervello e la funzione come microglia fagocitare eccesso di cellule progenitrici neurali del giro dentato dell&#39;ippocampo 1, 4. Microglia può anche modulare le diverse condizioni neurologiche che colpiscono il midollo spinale, come MS, dolore neuropatico, e le lesioni del midollo spinale 5-7. Microglia midollo spinale reagiscono in modo diverso rispetto al cervello microglia in risposta ai segnali di attivazione 8, 9, probabilmente a causa delle differenze nell&#39;ambiente locale. Quindi è importante stabilire un adeguato sistema in vitro per studiare la cultura e microglia midollo spinale. Microglia neonatali producono significativamente maggiore della citochina pro-infiammatoria ossido di azoto rispetto a cellule adulte dopo stimolazione in vitro con IFN-γ o TNF-a 10,11 un&#39;ulteriore evidenziando la necessità di utilizzare cellule adulte per studiare microglia nel contesto di alcune malattie. Il protocollo impieghiamo in laboratorio per culture microglia neonatale è una variazione di metodi recenti che utilizzano agitazione di colture gliali miste nel tentativo di rimuovere la microglia dalla superficie del pallone di coltura cellulare 12. Noi descriviamo anche un metodo per cultura microglia dal midollo spinale adulto topo basata su un protocollo prima descritto da Yip, et al 13. Questo metodo fornisce un modo più rapido per le cellule adulte della cultura rispetto ad altri protocolli disponibili 14. La preparazione risultante è del 70% microglia; la percentuale rimanente è costituita da astrociti. Sebbene la purezza della nostra cultura è più basso rispetto ad altri metodi pubblicati 13, questo sistema di coltura è utile per esplorare la microglia in coltura risposta a vari stimoli attivanti e anche per lo studio di malattie che colpiscono principalmente il midollo spinale e in cui una forte risposta infiammatoria è una caratteristica principale. Tutti i protocolli descritti sono stati approvati dalla Stony Brook University IACUC.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EDTA, 5mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lidocaine, 60mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-5647</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-000-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Biowittaker</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 x 10mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Poly-D-Lysine, 100 &mu;g/ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 1:20</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HBSS, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>20-023-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

culturing microglia from the neonatal and adult central nervous system

Microglia sono i residenti i macrofagi del sistema nervoso centrale (SNC) e, come tali, hanno ruoli criticamente importanti in processi fisiologici e patologici quali CNS maturazione in sviluppo, sclerosi multipla, e lesioni del midollo spinale. Microglia può essere attivato e reclutato per azione da lesioni o la stimolazione neuronale, come il danno assonale visto in MS o di un trauma cerebrale ischemico derivanti da ictus. Questi membri immunocompetenti del SNC sono anche pensato di avere un ruolo nella plasticità sinaptica in condizioni non patologiche. Impieghiamo protocolli per coltura microglia dai tessuti neonatali e adulti che mirano a massimizzare il numero di cellule vitali minimizzando variabili confondenti, quali la presenza di altri tipi di cellule del SNC e coltura detriti cellulari. Utilizziamo grandi e facilmente individuabile componenti del sistema nervoso centrale (ad esempio corteccia, segmenti del midollo spinale), che rende l&#39;intero processo fattibile e riproducibile. L&#39;uso di cellula adultas è una valida alternativa all&#39;uso di microglia cerebrale neonatale, come molte patologie indagate interessano principalmente l&#39;postnatale midollo spinale. Questi sistemi di coltura sono anche utile per testare direttamente l&#39;effetto di composti che possono sia inibire o promuovere attivazione della microglia. Dal attivazione della microglia può plasmare gli esiti delle malattie del sistema nervoso centrale adulto, vi è la necessità per i sistemi in vitro in cui microglia neonatale e adulta può essere coltivato e studiato.

<html> Un esempio di cellule microgliali riposo che attivate è mostrato in Figura 1. La microglia sono state visualizzate 24 ore dopo la placcatura (Figura 1a) e presentano ramificate (a riposo) morfologia. Esposizione al reagente adescamento, batteriche lipopolisaccaridi (LPS) provoca cambiamenti nella morfologia della microglia esempio le cellule diventano attivato (Figura 1b). Un esempio di contare le cellule per la placcatura è mostrato...

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Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Noi descriviamo i metodi per l&#39;efficiente e rapido isolamento / cultura della microglia praticabile dalla corteccia cerebrale neonatale e midollo spinale adulto. La dissezione e la placcatura di microglia corticale può essere realizzato entro 90 minuti, con la conseguente raccolta microglia in atto ~ 10 giorni dopo la dissezione iniziale.

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