Name: separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation
Uploaded: 2013-10-09T21:20:00
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この研究は、RGMにSLBとU54HD068157にNIHの助成金GM055360によってサポートされていました。 JMBはペンシルバニア大学（GM008216）でT32遺伝学研修助成金によって支えられている。

STA-PUTプロトコルは、3つの段階を含む：1）全体の精巣から細胞懸濁液の装置および試薬、2）準備、3）セルの負荷、沈降、およびフラクションコレクションのセットアップします。 2人の研究者のチームによって行われた場合に、プロトコルは、平均して8時間かかります。 1。 STA-PUT装置を設定します（図1） *** STA-PUT装置は、4℃、大規模な冷蔵庫や?...

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	<li>Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Spermatogenesis.">Mammalian Spermatogenesis.</a> Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).</li><li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche.">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).</li><li>Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+in+vitro+culture+to+in+vivo+models+to+study+testis+development+and+spermatogenesis.">From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis.</a> Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146, 519-532 (2011).</li><li>Easley, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+haploid+spermatogenic+cells.">Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells.</a> Cell Rep. 2, 440-446 (2012).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li><li>Miller, R. G., Phillips, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+elutriation:+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity.">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).</li><li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients.">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enrichment+of+undifferentiated+GFR+alpha+1++spermatogonia+from+immature+rat+testis+by+magnetic+activated+cell+sorting.">Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting.</a> Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).</li><li>Bellve, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).</li><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoprotein+transitions+during+spermiogenesis+in+mice+with+transition+nuclear+protein+Tnp1+and+Tnp2+mutations.">Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations.</a> Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).</li><li>Manku, G., Mazer, M., Culty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+testicular+gonocytes+isolation+and+processing+for+immunocytochemical+analysis.">Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis.</a> Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).</li><li>Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro,+short-term+culture+method+for+mammalian+haploid+round+spermatids+amenable+for+molecular+manipulation.">An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation.</a> Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).</li></ol>

信頼性の高い細胞培養系は、まだすべての精子形成細胞タイプ3を生成するために存在していないとして、精子形成を研究者たちは、精子形成細胞サンプルのための動物モデルに依存しています。精子形成細胞が容易に全体の精巣から収集しているが、唯一の混合集団をもたらす。これは、減数分裂細胞、円形精子、と凝縮精子細胞など、これらの細胞の特定のサブタイプを、勉強し?...

哺乳類の精子形成は精巣1の精細管にいくつかの段階で発生する複雑な分化過程である。簡単に言うと、精細管の格差の上皮の近くに存在する精原細胞のような幹、その後減数分裂を起こす精母細胞に分化。減数分裂が完了した後、得られた半数体細胞、または円形精子細胞は、精子、細胞質及び核の圧縮の脱落を伴う分化プロセスを受ける。精子細胞は徐々に、それぞれ、鞭毛を開発し、核の伸びや、結露を起こし、伸長してから凝縮する精子細胞を生成する。最終製品は、精細管の内腔に放出され、最終的に、彼らは、さらに成熟精巣上体にしている精子、です。 精子形成のプロセスは、特殊なホルモンや分子の状態に依存しているため精巣は、精子形成の全過程のための信頼できるインビトロ培養系は、まだ2,3開発されていない。培養方法は、幹細胞から「始原生殖細胞様細胞」および半数体、「円形精子細胞様細胞」を作成するために開発されてきたが、これらの方法はまだ、これらの細胞を大量に生成し、それ以降の精子形成細胞を生成するために失敗することができない種類4,5。幸いなことに、精子細胞型は液体勾配で分離されるべき全体の精巣から得られた単一細胞懸濁液を可能にする、サイズが大きく異なる。 STA-PUTメソッドは、ここに証明し、大きさや質量6-9に基づいて精子形成細胞を分離するための直線のBSA勾配とシンプルな沈降を使用しています。 FACSおよび水簸10-13：STA-PUT方法は精子形成細胞タイプを分離する他の二つの最も広く使用されている方法に勝るいくつかの利点を有する。 STA-PUT装置は、ONLが必要です寒い部屋や大きな冷蔵庫に組み立て専門のガラス器のY数枚。このように、セルソーター又は水簸機を使用するよりも安価である。 STA-PUT方法は、各細胞集団の純度はFACS 11で得られたものほど高くはないが、匹敵する時間枠内FACSによってソートすることができるよりも、細胞型および精巣あたりの細胞のより高い量をもたらす。磁気ビーズを用いて細胞選別（ソーティング磁気活性化細胞、MACS）は最近成功した混合精巣細胞集団から精原細胞の濃縮のために用いられてきたが、現在による適切な表面マーカー14についての知識の欠如のために精母細胞または精子細胞を分離するには不向きである。 MACSまたはFACSオーバーSTA-PUT方法のさらなる利点は、ほとんどのFACSプロトコルとは対照的に、それは任意のDNA染色又は他のタイプを必要としないので、その後の培養に適した生存可能な細胞を単離する能力である。 Lを必要とする研究のため精子形成細胞の種類のアーゲ収率は約90％の純度で、STA-PUTは、理想的な方法である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:109px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:255px;">10857 100MG</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="91">
			<td height="91" style="height:91px;width:311px;">KREBS (10x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20</td>
			<td style="width:183px;">Autoclave/filter and store at 4 &#176;C for several months.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">KREBS (1x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Collagenase</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">C9891-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">DNAse</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">DNEP-5MG</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Trypsin</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">T9201-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Triton-X100</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Formaldehyde (~37%)</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">TABLE 2: EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:255px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:311px;">Complete STA-PUT apparatus</td>
			<td style="width:109px;">ProScience Glass Shop</td>
			<td style="width:255px;">STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td>
			<td style="width:183px;">Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10 &#956;m mesh filter</td>
			<td style="width:109px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:255px;">22363549</td>
			<td style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mouse dissection tools</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:311px;">14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:547px;">Need approximately 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Fraction collector</td>
			<td style="width:109px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:255px;">Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Microscope slides, cover glass</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Light/Fluorescent Microscope</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

哺乳類の精子形成は、精巣の精細管にいくつかの段階で発生する複雑な分化過程である。現在のところ、 インビトロでの精子形成の分化を可能にする信頼性のある細胞培養系がなく、精子形成細胞のほとんどの生物学的研究は、マウスおよびラットのような動物モデルからの組織採取を必要とする。非精子形成（ライディッヒ、セルトリ、骨髄、および上皮細胞）および精子形成の両方（精原細胞、精母細胞、円形精子細胞、精子細胞および精子を凝縮） - - 精巣は多数の細胞型が含まれているため、精子形成に関与する生物学的メカニズムの研究を隔離を必要とするこれらの異なる細胞型の富化。この場合、精巣から - - BSA線形勾配を介してSTA-PUT方法は、不均一な細胞集団の分離を可能にする。個々の細胞型は、CEのに応じて異なる沈降速度で沈降llのサイズ、および異なる細胞型について富化画分を回収し、さらなる分析に利用することができる。 STA-PUT方法は、特定の細胞選別法を用いて得ることができるように、 例えば、細胞型の高純度画分をもたらさないが、各画分中の全細胞のより高い収量を提供しない （7-8×10 8細胞の出発集団から〜1×10 8個/精子形成細胞型）。この高い収率メソッドは特殊なガラス容器を必要とし、蛍光活性化セルソーター（FACS）又は水簸機等の特殊な装置へのアクセスが限られているラボのための理想的な方法で製造する、任意の低温室又は大冷蔵庫で行うことができる。

STA-PUTプロシージャから理想的な結果は、細胞の大きさおよび密度に基づいて、精巣からの細胞のかなり目立つ分離である。精巣から単離された細胞は、BSA勾配を介して沈降しているが、細胞のいくつかの別個のバンドが観察することができる。セルのいずれか塊は勾配の底に沈むようにし、他の画分を汚染しない傾向があります。もう少し勾配までは、大規模な体細胞および減数分裂細胞?...

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Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

STA-PUTメソッドは、大きさや密度に基づいて精子形成細胞の異なる集団の分離を可能にする。

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