Name: a method for culturing embryonic c. elegans cells
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

العلامات النجمية (*) تشير إلى خطوات جديدة أو معدلة بالمقارنة مع كريستنسن وآخرون. 1 1. إعداد المواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتطلب إجراء زراعة الخلايا كميات كبيرة من البيض معزولة عن البالغين حامل. ...

C. ايليجانس هو كائن نموذج فك رموز قوية لمسارات الجينية التي تساهم في التنمية والسلوك والشيخوخة. يلائمها ينبع في المقام الأول من السهولة التي يمكن التلاعب بها وراثيا ومن دورة حياة قصيرة. على الرغم يلائمها، C. ايليجانس لها حدودها. C. الخلايا ايليجانس ض...

انواع معينة ايليجانس (C. ايليجانس) هو كائن نموذج قوي للتحقيق الأسس الجزيئية وظيفة الخلوية، والتمايز، والسلوك. بينما في الجينوم، الأيض، المسارات البنائية تشبه الفقاريات &#39;، قابلية الإستطراق الوراثية والجزيئية التي هي أكبر بكثير 2. بين مزاياه وحجمها والتشريح بسيطة، ودورة الحياة السريع (3 أيام في 25 درجة مئوية)، فترة حياة قصيرة (2 أسابيع)، وعدد كبير من ذرية (&gt; 200). نظرا لطبيعتها خنثوي ودورة حياة قصيرة، التلاعب الجزيئية والجينية هي واضحة في C. ايليجانس، بما في ذلك جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا 3،4 وتطبيق تقنيات الجينات تدق إلى أسفل مثل تدخل الحمض النووي الريبي 5. C. الجسم ايليجانس وقشر البيض هي شفافة. لذا الخلايا يمكن تصور بسهولة في كل من الكبار والجنين باستخدام المجهر القياسية. في السنوات ال 40 الماضية، وC. ايليجانس </م&gt; وقد خلق مجتمع الموارد لا تقدر بثمن لC. البحث ايليجانس بما في ذلك مجموعة كبيرة من المسوخ، وبالضربة القاضية المعدلة وراثيا، وصفا مفصلا لعلم التشريح والتنمية 6،7، بما في ذلك إعادة كاملة للجهاز العصبي 8، والجينوم التسلسل تماما وهو مشروح بشكل جيد ومتاحة للمجتمع بأكمله ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). على الرغم من العديد من المزايا، وبعض المناهج التجريبية تم تحدي في C. ايليجانس. وتشمل هذه تلك التي تتطلب الوصول إلى غشاء البلازما من الخلايا والأنسجة أو عزل أنواع الخلايا. في الواقع C. تقتصر الأنسجة ايليجانس داخل هيكل عظمي الهيدروستاتيكي الضغط، والتي لا يتم هضمها بسهولة عن طريق العلاج الأنزيمية أو المنظفات. في نهاية 1990s ميريام غودمان وجانيت ريتشموند رائدة أساليب التسجيلات الكهربية من C. ايليجانسالخلايا العصبية والخلايا العضلية في الموقع 9،10. في حين أن هذه الأساليب قدم لنا معلومات هامة عن العصبية وظيفة العضلات في الجسم الحي، فهي صعبة وانخفاض الإنتاجية. وقد وضعت وسائل بديلة لدراسة وظيفة الخلايا في الجسم الحي، ومعظمهم لا سيما في مجال التصوير الكالسيوم الجسم الحي باستخدام أجهزة استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا مثل GCamP وCAMELEON 11-13. على الرغم من هذه الأساليب، لا تسمح باستخدام أدوات الدوائية لأنها تطبق على الحيوانات الحية سليمة. المحاولة الأولى في زراعة C. وقدم الخلايا ايليجانس في المختبر في نطاق واسع من قبل ليرد بلوم أثناء إعداد أطروحة الدكتوراه 14. للأسف، واجه صعوبات مع التصاق الفقراء من الخلايا إلى الركيزة، وسوء تمايز الخلايا والبقاء على قيد الحياة حالت دون قيام هذا البروتوكول في وقت مبكر باعتبارها طريقة قوية ثقافة الخلية. في عام 1995 نشرت إدغار وزملاؤه إجراءللتحقيق في انقسام الخلايا والتشكل من خلال العزلة وثقافة C واحد. ايليجانس أجنة 15. الخلايا الجنينية التي حصل عليها الهضم من قشر البيض مع مزيج من العلاج الأنزيمية والتفكك دليل، واصلت لتتكاثر، وتنتج ما يصل الى 500 ~ 15 الخلايا. في وقت لاحق، ليونج وزملاء العمل مثقف أعداد صغيرة من لدراسة التشكل عن Blastomeres المعوية. أنها أظهرت أن واحدا في المختبر معزولة E قسيم أرومي إنتاج الخلايا المعوية الاستقطاب التي خلقت بنية مشابهة لمعة الأمعاء من خلال التفاعل مع بعضهم البعض من خلال تقاطعات الملتصقة القمي 16. كما ذكرت بخنر وزملاؤه طريقة مماثلة لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في المختبر 17. على أساس هذا العمل في وقت مبكر، وضعت كريستنسن وزملاؤه بروتوكول قوية لزراعة الجنينية C. ايليجانس الخلايا في المختبر 1. همأظهرت أن معزولة C. ايليجانس الخلايا يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا المختلفة، والمحافظة على الميزات التي يمتلكها في الجسم الحي، بما في ذلك التعبير عن علامات خلية محددة. العديد من التقنيات التي تشكل تحديا في الجسم الحي، ويمكن تطبيقها على معزولة C. ايليجانس الخلايا الجنينية. وتشمل هذه الكهربية 1،18 19، والتصوير، وتقنيات immunochemical 20،21، وكذلك عزل أنواع معينة من الخلايا عن طريق خلية نيون المنشط الفرز (FACS) لبناء مكتبات [كدنا] خلية محددة 22،23. تقنيات الجينات ضربة قاضية مثل تدخل الحمض النووي الريبي (رني) يمكن تطبيقها على مثقف C. ايليجانس الخلايا 1 ورواية أسلوب وضع العلامات الأيضية باستخدام Azido السكر كأداة لاكتشاف بروتين سكري تم تطويرها مؤخرا للمثقف في المختبر C. ايليجانس الخلايا 24. في الختام، يوسع طريقة زراعة الخلايا المصفوفة ستقنيات و التي يمكن تطبيقها على C. ايليجانس نموذج في محاولة فك وظيفة الجين في سياق كائن حي. نحن هنا وصف بروتوكول لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في المختبر، والتي تقوم أساسا على البروتوكول وصف لأول مرة من قبل كريستيانسن و1 الزملاء.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. ايليجانس هو نظام نموذجي قوية، حيث التقنيات الوراثية الجزيئية وقابلة للتطبيق بسهولة. حتى وقت قريب على الرغم من التقنيات التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا وعزل أنواع معينة من الخلايا، لا يمكن تطبيقها في C. ايليجانس. وكان يرجع ذلك إلى حقيقة أن تقتصر الأنسجة داخل بشرة الضغط الذي لا يهضم بسهولة عن طريق العلاج مع الانزيمات و / أو المنظفات هذا القيد. على أساس العمل الرائد في وقت مبكر عن طريق ليرد بلوم، كريستنسن وزملاؤه 1 وضعت طريقة قوية لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في نطاق واسع. يتم عزل البيض من البالغين حامل عن طريق العلاج مع التبييض / هيدروكسيد الصوديوم وعلاجها في وقت لاحق مع كيتيناز لإزالة قشر البيض. ثم يتم فصل الخلايا الجنينية من قبل pipetting اليدوي ومطلي على الزجاج المغطاة الركيزة في وسائل الإعلام التخصيب المصل. في غضون 24 ساعة من زنازين العزل تبدأ في التفريق عن طريق تغيير التشكل وبالإعراب عن MARKE خلية معينةروبية. C. ايليجانس الخلايا مثقف باستخدام هذا الأسلوب البقاء على قيد الحياة لمدة تصل 2 أسابيع في المختبر، وكانت تستخدم للالكهربية، immunochemical، ويحلل التصوير، فضلا عن أنها تم فرزها واستخدامها لالتنميط ميكروأري.

C. ايليجانس الخلايا المستزرعة والتفريق خلية صريحة علامات محددة أظهرت كريستنسن وزملاؤه باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق أن&gt; 99٪ من الجنينية C. الخلايا ايليجانس تنجو من إجراء العزل. في يوم 9 و 22 بعد الطلاء، 85٪ و 65٪ على الت...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video at JoVE.com

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells Video (Video) | JoVE

نحن هنا وصف البروتوكول المنقح للثقافة واسعة النطاق من الجنينية C. ايليجانس الخلايا. الجنينية C. ايليجانس الخلايا المستزرعة في المختبر باستخدام هذا الأسلوب، ويبدو أن التفريق وألخص التعبير عن الجينات بطريقة معينة من الخلايا. التقنيات التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا أو عزل أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة الأخرى يمكن تطبيقها على C. ايليجانس الخلايا المستزرعة.

منهج في التثقيف الجنينية<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; خلايا

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection Video (Video) | JoVE

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes Video (Video) | JoVE

تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping Video (Video) | JoVE

الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation Video (Video) | JoVE

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker Video (Video) | JoVE

لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations Video (Video) | JoVE

قوية من الجيل الكبدية مثل خلايا الجنينية البشرية من السكان الخلايا الجذعية

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans Video (Video) | JoVE

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

إعداد خلايا الفأر الجنينية الخلايا الليفية مناسبة للالإنسان التثقيف الجنينية والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas Video (Video) | JoVE

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation Video (Video) | JoVE

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...